terça-feira, 12 de janeiro de 2021

PRATA COLOIDAL E CÃES

Cinomose (liquida 20ppm) 

Dermatite causada por pulgas e insetos

Dermatite por agentes externos

Leishimaniose (liquida 20ppm)

Manchas de lágrimas e infecções oculares

Infecções de ouvido

Úlceras de roedor

Problemas de dentes, incluindo gengivite e estomatite (ver mais abaixo)

Abscessos

Feridas

Ajuda a eliminar parasitas matando as ovas (precisa de vermífugo para vermes adultos e grandes infestações)

Infecções por fungos

Dermatite úmida (gel e spray)

MRSA (liquida e gel conforme o local)

Infecção por TVT genital (sabonete e gel)

Preservação de alimentos

Herpes canino

Papilomatose bucal (gel)

Verrrugas virais (liquido, gel e sabonete)

Controle de pulgas, carrapatos e ácaros, pois mata as ovas desses parasitas. (spray 100ppm)

Picadas de insetos 



A prata coloidal para cães é um recurso natural maravilhoso para uma variedade de condições. É um tratamento seguro, de baixo custo e eficaz para cães e gatos. A prata coloidal tem sido usada para tratar com sucesso cães e gatos por muitos anos, no Japão e em diversos locais do mundo.



Alguns animais de forma rara apresentam alergia, assim como ocorre como humanos, porém antes faça um teste de pele e de mucosa e pingue algumas gotas na bota e observe, pois par uma alérgico uma gota já mostra. Em caso de alergia é só não dar mais e dar um antialérgico.



A prata coloidal é uma alternativa excepcional aos remédios de venda livre, antibióticos farmacêuticos e prescrições administradas aos seus cães. Pode ser administrado no seu cão uso interno e externo e adicionado na água em doses baixas conforme a necessidade. Existe o gel com prata, líquida que pode ser ingerida a 20ppm e feito inalação.



Apresenta-se líquida, em gel e sabonete.



Embora se diga que não há cura médica para cinomose, leishmaniose, coronavirose, parvovírus, a prata é muito eficaz na dose correta e associada ao tratamento do sistema imunológico e desparasitação. O tempo de uso é o tempo de vida do vírus ou bactéria in vitro ou sem capacidade de reprodução, por exemplo, no caso da cinomose leva 60 dias consecutivos com suplementação vitamínica.



O mais importante é a dosagem que foi pesquisada pelo nosso amigo o Veterinário Dr. Hélio Rebelo da Universidade Federal do Pará que chegou a uma dosagem adequada em testes para um cãos com cinomose com cura de 100% sem sequelas porque iniciou o tratamento no início. A dosagem é de 1/3 do peso do animal em ml, ou seja, Se o animal pesa 9 kg divida por 3 e terá o valor do ml, no caso, 3 ml. Divida esses 3 ml em duas doses e de 1,5 pela manhã e 1,5 a noite. A dose é dividida porque o metabolismo é acelerado.





É recomendado em doenças graves, iniciar com doses menores mudando a cada 3 dias, para não ocorrer um excesso de patógenos como fungos e bactérias mortos na corrente sanguínea, de forma que o organismo possa eliminar.



Algumas doenças requerem um tratamento mais agressivo, por isso o acompanhamento de um veterinário seria essencial, pois se seu veterinário não conhece a prata coloidal e a doença for grave, explique, é um tratamento natural e eficaz com muitas pesquisas disponíveis na Revista de Ciências Biológicas dos Estados Unidos.



Isso é contrário a outros sites que eu vi na internet, que dizem dar algumas gotas. Isso não faz sentido. Mais do que algumas gotas são necessárias para acabar com uma infecção. Não fique nervoso sobre a dosagem pesada para uma condição crônica ou aguda que precisa de uma atenção séria.



Na pele para fungos críticos como Sporotrix e outros o uso é externo de prata coloidal de 100ppm liquida e gel associadas a suplementação urgente par ao sistema imunológico.



Pulverize prata coloidal líquida de 100ppm, não diluída diretamente sobre irritações e feridas da pele, duas a três vezes por dia durante o tempo necessário até que a condição melhore visivelmente.



Mais dúvidas chame no Whatsapp da Naturals Brazil com seu nome e o assunto: 11 98624-1390



Obs: Não esqueça, a orientação de um veterinário, principalmente naturalista, é essencial.



Fontes pesquisa:



https://naturalsbrazil.blogspot.com/2021/01/prata-coloidal-e-cinomose.html



https://naturalsbrazil.blogspot.com/2019/06/prata-coloidal-e-leishmaniose-visceral.html



https://naturalsbrazil.blogspot.com/2019/01/prata-coloidal-mata-toxoplasma-gondii.html



https://naturalsbrazil.wordpress.com/2013/05/27/prata-coloidal-e-uso-veterinario/ (não injetar)



https://naturalsbrazil.blogspot.com/2019/06/a-prata-e-raiva-canina-estudo-europeu.html



https://holisticpetcare.com/pet-care-blog/colloidal-silver-for-cats/&prev=search



https://www.cuteness.com/article/administer-colloidal-silver-cats





PRATA COLOIDAL E CINOMOSE


Sabia que a prata coloidal cura a cinomose, aliada a um tratamento de aumento do sistema imunológico do animal?

PRATA ATUANDO NO VÍRUS

A prata não mata o vírus, ela age de forma diferente no organismo com relação as bactérias e fungos.

A prata coloidal não mata vírus, ela protege a célula aderindo-se a parede dessa célula pela carga magnética que possui e evita que o vírus "entre" e se multiplique, com isso, no período de vida do vírus, ele não conseguirá infectar as células e se multiplicar e seu próprio organismo dará cabo de todos os hospedeiros indesejados.

Os vírus são seres que não possuem células, são constituídos por ácido nucleico que pode ser o DNA ou o RNA, envolvido por um invólucro proteico denominado capsídeo. Possuem cerca de 0,1µm de diâmetro, com dimensões apenas observáveis ao microscópio eletrônico.

Por serem tão pequenos conseguem invadir células, inclusive a de organismos unicelulares, como as bactérias. É parasitando células de outros organismos que os vírus conseguem reproduzir-se. Por essa razão o mecanismo que atua na eliminação das bactérias e fungos pela prata não é o mesmo dos vírus.

Caso uma bactéria esteja infectada por vírus, ai sim o processo será outro.

Um fator importante no uso da prata para para tratar viroses é ter um diagnóstico preciso por um médico para saber qual o vírus , o período de incubação e o período de vida dele no seu organismo, pois o tratamento dura exatamente esse tempo.

Entenda, você está contaminado e um exemplo: o vírus X vive 45 dias normalmente em condições favoráveis, então dependendo da gravidade, você tomará X ml por 50 dias pela manhã em jejum associado a uma alimentação que favoreça o fortalecimento do sistema imunológico ou um complexo vitamínico bom.

A prata cumprira a função dela nesse caso e e seu sistema imunológico também, eliminando o parasita.

Saiba que tomar a menos, não surtirá o efeito desejado e tomar a mais também não, pois se tornará uma faca de dois gumes, de um lado não haverá cura e o outro poderá tornar seu sistema imunológico, com o tempo acomodado, pois ao beber não apenas servirá para a virose, mas também para tudo o mais, interferindo na flora e fauna microscópica do seu organismo.

Por isso, que muitos dizem que a prata é ineficiente contra vírus, mas não levam em conta tipo de vírus, tempo de vida e contexto do organismo do individuo, que vai determinar dosagem e tempo de tratamento.

Creio que ninguém tenha lhe explico isso, mas fique ciente, pois é comprovadamente cientifico. Muitos testes em laboratórios feito em Universidades americanas relatam isso, porém é muito pouco divulgado.

Então essa é a função da prata no caso de viroses, bloquear a contaminação das células e nada mais, entendeu?

Passa a ser, por isso , um tratamento mais demorado e disciplinado.

COMO TRATAR

É necessário que um veterinário avalie o estágio no qual a cinomose, pois quanto mais cedo, mais eficiência e menos sequelas.

Você pode pesquisar sobre as fases da doença no google, mas a informação que queremos passar é que o vírus vive em média no organismo, caso ele não se reproduza por 50 dias aproximadamente. Então iniciar o uso da prata e a introdução de complexos vitamínicos para o organismo aumentar a defesa é imprescindível, não esqueça.

Como você leu acima, a prata irá proteger a célula e o vírus não se reproduzirá, assim o tempo de tratamento é de 60 a 70 dias, o suficiente para organismo, sem o vírus se reproduzir, elimine o vírus por completo.

O mesmo serve para qualquer vírus que ataca que o organismo animal, onde o tratamento vai além do tempo de vida do vírus.

Cuidados com o ambiente são necessários, não esqueça, fora do organismo o vírus é sensível, porém infectante.

DOSE

De acordo com as pesquisas do veterinário Helio Rebelo, em sua tese, a dose média é de 1/3 em ml de prata coloidal a 20 ppm, do peso do animal. Exemplo: Seu animal pesa 12 kilos, será 4 a 6 ml (conforme a fase) , divididos em 2 doses diárias + as vitaminas e a alimentação.

Ele testou em tecido vivo com vários níveis de infecção, quanto mais cedo, eficiência de 100%, quanto mais tarde, pode-se chegar a 80% de cura total em mais tempo.

Alguns animais tem alergia ao metal, assim, deve-se fazer um teste na mucosa, da boca antes para ver se o animal não apresenta reação.

Hoje, animal morre de cinomose por simples desinformação e falta de vacinação. Seja sempre responsável com seu animalzinho.

Naturals Brazil

terça-feira, 5 de janeiro de 2021

COMO DEVE SER A PRATA COLOIDAL QUE VOCÊ COMPRAR




Primeiro, saber se ela é coloidal verdadeira ou iônica, ou mista.

Se o vendedor omitir, à distância você vai saber fazendo as seguintes perguntas:



- IDENTIFICAÇÃO

Deve ter rótulo com nome da empresa, ppm, ml, data de validade, lote de fabricação no mínimo e acompanhar um informativo ou uma bula dentro da ABNT com letras legíveis e com clareza de leitura.



- QUE COR É A SUA PRATA?

Verdadeira: Amarela (varia tom conforme ppm)

Mista: Amarela (varia tom conforme ppm)

Iônica: Transparente



- QUAL A VOLTAGEM E A AMPERAGEM DA FONTE QUE USOU PARA FAZER?

Para prata verdadeira, no processo de eletrólise que é a ideal para tratamentos, deve ser:

Voltagem ideal: 24 a 33 Volts

Amperagem: 0,01 a 0,04A (ampere), no máximo, para produzir partículas de 1 a 20 nanômetros na média. Ampere acima até 0,5ª faz prata coloidal, mas com partículas maiores para outros fins.





- QUE ÁGUA VOCÊ USOU?

Deve ser sempre destilada ou de osmose reversa 0 ppm



- A PRATA QUE VOCÊ USOU QUAL A PUREZA?

A prata deve ser 999 ou 1000, pura e normalmente vem em grânulos e é moldada para o formato palitou eletrodo.



- EXISTE NORMA QUE REGE A PRATA COLOIDAL?

Não diga qual é, testar os conhecimentos de quem vende é muito bom, mas a norma que rege é americana e a única no mundo que determina uma dose de segurança, é a Norma Prata (CASRN 7440-22-4) do EPA americano que diz o seguinte: A dose de segurança para a prata coloidal (verdadeira) é de 1 a 25 ml dia de prata coloidal de 15 a 20 ppm para uma pessoa com média de peso de 70kg uma vez ao dia.



Doses abaixo ou acima não tem efeito ou podem acumular dentro de você, seus sistema excretor precisa eliminar a prata e os patógenos que morrem e se for muito não conseguirá.



- EMBALAGEM DE VIDRO OU PET?

Pet deve ser o Pet farmacêutico ou cosmético, senão não pode. O Pet farmacêutico permite que a prata mantenha suas características e ppms por mais tempo guardando na temperatura ambiente. Se for prata coloidal verdadeira pode ficar até em frasco transparente, se for mista ou iônica ai precisa de escuro, porque reage com os raios UV, perde a propriedade elétrica fica preta e decanta.



O frasco de vidro também é muito bom, mas conforme já publicamos no vidro a prata perde as ppms porque o vidro adsorve a prata nas suas paredes, então não é bom para guardar a longo prazo. Lembrando que o que estou explicando é químico, não inventei e nem me disseram, ok?



Se o vendedor se negar a te dar essas informações básicas desconfie, porque quem faz a coisa certa não tem o que esconder, embora possa mentir e até ler esse artigo, não é? Por isso, o teste abaixo:



********************************************************************



AGORA PARA TESTAR?



Infelizmente somente quando você receber, ai pode fazer os seguintes testes, seguindo a risca, use copos ou recipiente transparente.

· Efeito thyndall: com um laser você precisa ver o feixe de luz atravessando o recipiente. O Efeito Tyndall ocorre quando há a dispersão da luz pelas partículas coloidais. Neste caso, é possível visualizar o trajeto que a luz faz, pois estas partículas dispersam os raios luminosos. Uma solução coloidal ou coloide possui o diâmetro médio de suas partículas dispersas entre 1 e 100 nm.

· COR: amarela com tons conforme ppm

· Agora o teste xarada que todo mundo tem medo: Pegue um copo transparente, coloque 30ml de prata coloidal de 20ppm (ppm muito alta não dá certo). Pegue sal de cozinha comum (rosa, negro, marinho, não porque tem outros minerais) porque tem somente cloreto de sódio, puxe com o dedo de 15 a 20 grãos finos e coloque no copo, gire o copo par ao sal de mover no fundo. Se subir uma nevoa branca ou a prata amarela ficar esbranquiçada e não translucida significa que tem prata iônica junto. Se a prata for transparente e iônica pode fazer a nevoa ou ficar preta e decantar.

Isso acontece porque o cloreto do sal se lida ao íon da prata iônica e forma o cloreto de prata que não pode ser ingerido e é tóxico. No seu corpo essa prata encontra os outros cloretos começando no estomago e sofre o mesmo processo. A prata iônica tem menos de 1 nanômetro e passa pela membrana celular, interage com ela e fica lá dentro podendo causar Argyria a longo prazo e até necrose em órgãos.



Se não for a prata coloidal verdadeira, você tem o direito pelo código do consumidor a trocar, devolver e ter seu dinheiro de volta.



Pare de se envenenar.



Também atente ao cobre coloidal que é tóxico a médio e longo prazo. O Bioquímico Kephra avisa isso sempre em seu fórum porque as pessoas insistem em tomar.



Naturals Brazil

 

 


domingo, 3 de janeiro de 2021

TRATANDO COVID COM A PRATA COLOIDAL


Sempre falamos do uso da prata para prevenção associado a reformo imunológico, porém muita gente perguntando, inclusive médicos e terapeutas como tratar já estando com Covid.

Primeiro passo é o diagnóstico médico e manter os cuidados que o médico indicar.

Segundo, usar a prata coloidal de 20ppm como coadjuvante associada, também ao reforço imunológico. (Pode usar as ppms altas adaptando a dose para equivaler a de 20ppm).

 

1º CASO

Pessoas com sintomas como febre, infecções, pneumonia e outros transtornos, devem iniciar com uma dose menor de prata coloidal de 20 ppm e a cada 5 dias ir aumentando para que outros patógenos, que não o vírus, possam ser eliminados primeiro sem causar sobrecarga ao sistema urinário e ao fígado.

 

Assim, inicie com 5 ml e a cada 5 dias aumente para 10 e depois 15, se a pessoa tiver acima de 71 quilos pode chegar a 20 ml por 30 dias.

 

2º CASO

Pessoas com poucos sintomas ou assintomáticos, podem iniciar doses de 15 ml ou 20 ml tendo de 60 kg para cima. Pessoas com 100kg podem usar 25 ml dias por 30 dias, não excedendo os 25 ml que é a dose de segurança determinada pelo EPA Americano.

Manter os cuidados médicos.

 

3º CASO

Pessoas que usam a prata em doses preventivas de 5ml, que são contaminados, geralmente com baixo sintoma ou nenhum, por uma defasagem do sistema imunológico, devem aumentar a dosagem para 15 ml, 20ml ou 25ml conforme 2º caso.

 

CRIANÇAS

É preciso calcular a dosagem de acordo com o peso seguindo a fórmula (dose de um adulto x 70kg =  y  /   y x o peso da criança = ml a ser ingerido)

 

NÃO INDICADO

- Mulheres grávidas e mulheres que amamentam, porque a prata acumula no cérebro do bebê e do feto conforme pesquisa com ratinhos que já publicamos.

- Pessoas com cirrose e transtornos graves no fígado, porque não elimina os resíduos dos patógenos mortos com eficácia.

- Pessoas com transtornos graves nos rins, porque não elimina os resíduos dos patógenos mortos com eficácia.

- Pessoas alérgicas a ingestão de prata

- Crianças e bebês em caso de necessidade

Se houver necessidade fazer com acompanhamento médico

No geral é bem simples e eficaz, sempre mantendo os cuidados com higiene de objetos e ambiente usando prata coloidal de 100ppm, uso da máscara, na qual você pode borrifar a prata de 100ppm.

 

Escolha locais mais vazios para ir, horários que não sejam de pico para os comércios e assim, conseguiremos com consciência sumir com esse vírus e manter distância dos inconscientes e irresponsáveis na medida certa, levando uma rotina saudável física e emocional.

 

Naturals Brazil

 

Se desejar comprar ou experimentar (transportadora e entregas no Mesmo dia para SP e Grande SP):

https://lista.mercadolivre.com.br/_Desde_49_CustId_79620577

 

ou Loja: https://www.naturalsbrazil.com.br/prata-e-ouro




segunda-feira, 28 de dezembro de 2020

Efeito antiviral potente de nanopartículas de prata em SARS-CoV-2

 Pesquisa completa


Reconhecimentos

O estudo foi financiado pela Agência Japonesa para Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED), número de concessão: 19fk0108110h0401 e 20he0522001j0001.


 . 26 de novembro de 2020; 533 (1): 195–200.
Publicado online 11 de setembro de 2020 doi:  10.1016 / j.bbrc.2020.09.018
PMCID: PMC7486059
PMID: 32958250

Efeito antiviral potente de nanopartículas de prata em SARS-CoV-2

Sundararaj S. Jeremiah , um Kei Miyakawa , um Takeshi Morita , um Yutaro Yamaoka , , um b e Akihide Ryo um, *

Dados Associados

Materiais Suplementares

1. Introdução

O metal elementar, Prata (Ag) tem ação antimicrobiana de amplo espectro contra várias bactérias, fungos e vírus. Devido à sua versatilidade, as nanopartículas de Ag (AgNP) encontraram atualmente seu caminho como um microbicida para superfícies biológicas em várias formas, como curativos para feridas, dispositivos médicos, sprays desodorantes e tecidos. Vários estudos demonstraram a potente ação antiviral dos AgNPs contra vários vírus patogênicos humanos, como vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da influenza, norovírus, vírus da hepatite B (HBV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV) [  ]. Além desses vírus, uma vez que foi demonstrado que o Ag mata o SARS-CoV, formulamos a hipótese da forte possibilidade dos AgNPs inibirem o SARS-CoV-2 [  , Até o momento, não há estudos que demonstrem diretamente o efeito dos AgNPs na SARS-CoV-2. Testamos prata coloidal (cAg), nanopartículas de Ag elementar simples de diferentes diâmetros (AgNP n ) e nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com polivinilpirrolidona (PVP – AgNP 10 ) contra SARS-CoV-2 para encontrar o tamanho e a concentração de Ag mais eficazes que poderiam inibir SARS-CoV-2. Propomos que os AgNPs possam ser usados ​​em superfícies inanimadas e não biológicas para controlar de forma eficiente a pandemia de COVID-19 em curso, ao mesmo tempo em que se toma cuidado para não abusar dela.

2. Materiais e métodos

2.1. Cultura de células e propagação de vírus

VeroE6 / TMPRSS2 (células VeroE6 expressando de forma estável a serina protease transmembrana TMPRSS2, JCRB # 1819) e as linhas de células Calu-3 foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS [  ]. O SARS-CoV-2 (JPN / TY / WK-521) foi obtido do NIID, JAPÃO, armazenado em alíquotas a −80 ° C e manuseado em nível de biossegurança 3 (BSL3). Durante a realização de estudos de infecção por SARS-CoV-2, foi usado DMEM contendo 2% de FBS.

2.2. Ensaio de placa

O ensaio de placa foi realizado SARS-CoV-2 nas linhas de células VeroE6 / TMPRSS2 e Calu-3 como descrito em outro lugar com pequenas modificações [  ]. Placas de 96 cavidades foram semeadas com 5 x 10 4  culas por po em 10% de FBS / DMEM e deixou-se crescer durante a noite. A solução viral foi diluída em diluições em série de 10 vezes em 2% de FBS / DMEM. Os sobrenadantes dos poços foram removidos e substituídos por diluições virais em poços correspondentemente marcados e incubados a 37 ° C por 96 h, após o que as células foram fixadas com formalina a 4% e coradas com violeta de cristal 0,25% para visualizar as placas contra um fundo branco. A dose média de infecção de cultura de tecido (TCID50) e a multiplicidade de infecção (MOI) foram calculadas a partir de testes em quadruplicado.

2.3. Formulações de prata

PVP-AgNP 10 na concentração de estoque de 20 ppm (Cat No: 795925) e cAg (Cat No: 85131) foram obtidos da Sigma. AgNPs de tamanhos diferentes; AgNP 2 (Cat No: US7150), AgNP 15 (Cat No: US7091), AgNP 50 , AgNP 80 e AgNP 100 (US1038W) foram adquiridos de US Research Nanomaterials, Inc. Todas as formulações de prata foram dispersas em água e o desejado concentração foi preparada por diluição em água destilada estéril.

2.4. Ensaio de viabilidade celular

O Ensaio de Viabilidade Celular CellTiter-Glo (Promega) é um ensaio baseado em luminescência que detecta quantitativamente células vivas com base nos níveis de trifosfato de adenosina (ATP). A morte celular subsequente à citotoxicidade mediada por Ag ou infecção viral pode ser rapidamente quantificada usando Cell-Titer Glo [  ]. 50 μl de substrato CellTiter-Glo (Promega) foram adicionados às células e sua viabilidade foi medida com base nas intensidades de luminescência detectadas pelo Sistema GloMax Discover (Promega) 10 minutos depois.

2,5. RT-qPCR

O RNA viral foi extraído dos sobrenadantes da cultura usando QIAamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) e armazenado a -80 ° C até análise posterior. O RNA viral extraído foi quantificado usando CFX96 Real-Time System (Bio-rad) com TaqMan Fast virus 1-Step Master Mix (Thermo) usando 5′-AAATTTTGGGGACCAGGAAC-3 ′ e 5′-TGGCAGCTGTGTAGGTCAA-3 ′ como conjunto de primer e 5'-FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ-3 'como sonda [  ].

2.6. Estudos de citotoxicidade

cAg ou AgNPs na concentração desejada foram adicionados às linhas celulares VeroE6 / TMPRSS2 ou Calu-3 cultivadas em placas brancas de 96 poços e foram incubados a 37 ° C por 48 ou 96 h, respectivamente, após o que as células foram lavadas com PBS e a viabilidade foi quantificado usando o ensaio CellTiter-Glo.

3. Estudos de interação de prata e SARS-CoV-2

3.1. Ensaio de pré-tratamento de vírus

O vírus a um MOI de 0,05 (para VeroE6 / TMPRSS2) ou 0,5 (para Calu-3) em DMEM contendo 2% de FBS foi incubado com 2 ppm de solução de AgNP por 1 h a 37 ° C. A mistura de vírus-AgNP correspondente foi adicionada a células VeroE6 / TMPRSS2 ou Calu-3 em placas de 96 poços e incubadas por 48 h ou 96 h respectivamente a 37 ° C. A viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio CellTiter-Glo e as cópias virais no sobrenadante foram quantificadas por RT-qPCR.

3.2. Ensaio celular pós-tratamento

Células VeroE6 / TMPRSS2 foram infectadas com SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) e incubadas por 2 h a 37 ° C. Os poços foram lavados com PBS para remover vírus extracelulares e completados com DMEM contendo 2% de FBS com 2 ppm de PVP-AgNP 10 e incubados por 48 h a 37 ° C. A viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio CellTiter-Glo e as cópias virais no sobrenadante foram quantificadas por RT-qPCR.

3.3. Ensaio de pré-tratamento celular

Células VeroE6 / TMPRSS2 foram tratadas com 2 ppm de PVP-AgNP 10 e incubadas por 3 h a 37 ° C. Os poços foram então lavados com PBS para remover AgNPs livres no meio e completados com DMEM contendo 2% de FBS com SARS-CoV-2 (MOI = 0,05) e incubados por 48 h a 37 ° C. A viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio CellTiter-Glo e as cópias virais no sobrenadante foram quantificadas por RT-qPCR.

3.4. Imunofluorescência

As células foram fixadas com paraformaldeído 4% e permeabilizadas com Triton X-100 0,5%, sendo então bloqueadas com Blocking One (Nacalai) em temperatura ambiente por 15 min. As células foram incubadas com o anticorpo policlonal contra o anticorpo da proteína do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 (diluição 1: 100, Novus NB100-56576) à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, as células foram coradas com anticorpo anti-coelho marcado com Alexa 568 (diluição 1: 1000, Thermo) durante 1 h à temperatura ambiente. O núcleo foi corado com ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI (Thermo). As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência BZ-9000 (Keyence).

3,5. Ensaio de entrada de pseudovírus

Lentivírus de pseudótipo foi produzido por transfecção transitória de células HEK293 com pNL4-3. Luc.RE− e pSARS2-Spike-FLAG em uma proporção de 1: 1. Os sobrenadantes da cultura contendo pseudovírus foram coletados 48 h após a transfecção e filtrados através de um filtro Millex-HV de 0,45 μm (Merck). Para o ensaio de entrada, células VeroE6 / TMPRSS2 semeadas em placas de 96 poços foram lavadas e inoculadas com 100 μl de meio contendo pseudovírus com ou sem PVP-AgNP 10 . O anticorpo neutralizante foi usado como controle para a inibição de entrada. 48 horas após a inoculação, as células foram lavadas e adicionadas com 40 μl de Bright-Glo Substrate (Promega). A atividade da luciferase é medida com o GloMax Discover System (Promega).

4. Resultados

4.1. Citotoxicidade, dose efetiva e tempo de contato

AgNPs exibem citotoxicidade para células de mamíferos, gerando espécies reativas de oxigênio (ROS) [  ]. Queríamos avaliar a citotoxicidade dependente da concentração exibida por Ag nas linhas celulares VeroE6 / TMPRSS2 (origem não humana) e Calu-3 (célula epitelial do pulmão humano). O cAg foi diluído em série e adicionado às células em placas de 96 poços e a viabilidade celular foi avaliada após 48 h usando o ensaio CellTiter-Glo. Ag foi encontrado para exibir citotoxicidade em concentrações de 20 partes por milhão (ppm) em diante em ambos VeroE6 / TMPRSS2 (Figura 1 A) e linhas celulares Calu-3 (Figura 1B).

Figura 1

Citotoxicidade da prata coloidal em células de mamíferos 1A : Citotoxicidade exibida por concentrações em série de prata coloidal em células VeroE6 / TMPRSS2. 1B : Citotoxicidade exibida por concentrações em série de prata coloidal em células Calu-3.

Uma vez que o cAg contém tamanhos de partícula que variam de 1 a 1000 nm, nós o usamos como uma triagem inicial para verificar o efeito dos AgNPs no SARS-CoV-2. A multiplicidade de infecção (MOI) de SARS-CoV-2 foi calculada por experimentos independentes e verificou-se ser 0,05 e 0,5 para VeroE6 / TMPRSS2 e Calu-3, respectivamente. A suspensão viral em um MOI fixo foi tratada com cada diluição em série de cAg por 1 h e depois inoculada em células VeroE6 / TMPRSS2 e Calu-3.Figura 2 UMA). Em células Calu-3, foi observada redução significativa da carga viral na faixa de concentração de cAg semelhante (Figura 2B). Embora os íons metálicos sejam inibidores conhecidos da PCR em altas concentrações, confirmamos que, na concentração efetiva (2 ppm), o Ag não inibiu a amplificação e é adequado para analisar o RNA viral em amostras contendo Ag ( Fig. S1 ) [  ]. Uma vez que 2 ppm também era 10 vezes menor do que a concentração citotóxica, foi escolhido como a concentração desejada para testes adicionais.

Figura 2

Concentração e efeito antiviral dependente da dose de nanopartículas de prata nuas em SARS-CoV-2. 2A: A prata coloidal resgata células VeroE6 / TMPRSS2 da morte celular mediada por SARS-CoV-2 de uma maneira dependente da concentração. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2B: Inibição dependente da concentração da replicação do SARS-CoV-2 em células Calu-3 pela prata coloidal. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,001 (∗∗∗). 2C : Nanopartículas de prata exibem ação antiviral dependente do tamanho contra SARS-CoV-2 em células Vero / TMPRSS2. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2D: Inibição viral dependente do tamanho de SARS-CoV-2 por nanopartículas de prata em células Calu-3. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,001 (∗∗∗).

Estudos anteriores documentaram a potência dependente do tamanho dos AgNPs na inativação viral, com tamanho de partícula ≤10 nm relatado como tendo efeito antiviral máximo [ Uma vez que o cAg contém vários tamanhos de partículas de Ag, previmos que as partículas em torno de 10 nm de tamanho no cAg teriam exercido o efeito antiviral. Para provar isso, empregamos o ensaio de pré-tratamento de vírus (VPrA) para testar o efeito antiviral de AgNPs de diferentes tamanhos variando de 2 a 100 nm em vírus extracelulares. O vírus foi tratado com solução de 2 ppm de AgNPs de tamanhos diferentes por 1 h e a mistura de vírus-AgNP foi adicionada às células VeroE6 / TMPRSS2 e Calu-3. A viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio CellTiter-Glo em VeroE6 / TMPRSS2 e as cópias virais no sobrenadante foram quantificadas por RT-qPCR em células Calu-3. O efeito antiviral foi observado com AgNPs de tamanho variando de 2 a 15 nm (Figura 2C e D). AgNP 2 mostrou citotoxicidade a 2 ppm, enquanto outros tamanhos não ( Fig. S2 ). Por isso, escolhemos PVP-AgNP 10 para testes adicionais. Uma vez que observamos excelente atividade antiviral em VPrA em 1 h, queríamos saber o tempo mínimo de contato exigido pelo Ag para a inibição viral. O estudo de curso de tempo realizado com base em VPrA com PVP-AgNP 10 revelou inibição significativa além de 30 min de contato ( Fig. S3 ).

4.2. A prata inibe os vírus extracelulares, evitando a entrada viral

Em seguida, realizamos o VPrA, o ensaio de pós-tratamento celular (CPoA) e o ensaio de pré-tratamento celular (CPrA) em SARS-CoV-2 usando PVP-AgNP 10 em VeroE6 / TMPRSS2 para observar o efeito de Ag em vírus extracelulares e intracelulares (Fig. 3 UMA). O VPrA mostrou inibição eficaz dos vírions livres extracelulares caracterizados pela redução da morte celular e também por uma queda acentuada na carga viral para níveis desprezíveis (Fig. 3B e C). Além disso, realizamos o CPoA para detectar a capacidade do Ag de suprimir o vírus em células já infectadas. Neste projeto experimental, células VeroE6 / TMPRSS2 foram infectadas com SARS-CoV-2 (MOI 0,05) por 2 horas após as quais os vírus extracelulares foram lavados e, em seguida, as células infectadas foram tratadas com 2 ppm de PVP-AgNP 10 . Observamos proteção significativa das células infectadas e supressão da carga viral com PVP-AgNP 10 (Fig. 3B e C). Além disso, realizamos o CPrA para avaliar a capacidade das células pré-tratadas com prata em resistir à infecção viral. As células VeroE6 / TMPRSS2 foram incubadas com 2 ppm de PVP-AgNP 10 por 3 h, após o que as células foram lavadas para remover a prata não ligada seguida por infecção com SARS-CoV-2 (MOI 0,05). Ao final de 48 h, o vírus foi encontrado apenas parcialmente inibido (Fig. 3C).

Fig. 3

Nanopartículas de prata inibem efetivamente a SARS-CoV-2 extracelular. 3A : Representação esquemática do ensaio de pré-tratamento de vírus (painel superior), ensaio de pós-tratamento de células (painel central) e ensaio de pré-tratamento de células (painel inferior). 3B : Desempenho de nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com PVP nos três projetos de estudo com relação ao resgate de células da infecção por SARS-CoV-2. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,005 (∗∗∗). 2C : Desempenho de nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com PVP nos três projetos de estudo com relação à redução da replicação de SARS-CoV-2. Barras de erro obtidas a partir de testes em triplicado. valor de p ≤ 0,001 (∗∗∗).

Confirmamos o efeito antiviral dependente do tamanho do PVP-AgNP 10 usando a análise de imunofluorescência realizada no modelo experimental VPrA; A infecção por SARS-CoV-2 foi efetivamente evitada pelo AgNP 10 e não pelo AgNP 100 (Fig. 4 UMA). O ensaio de placa revelou que a prata atingiu a inibição completa de 0,05 MOI, que é um log 10 vezes mais do que o controle do vírus. A inibição parcial foi observada com cargas virais mais altas a partir de 0,5 MOI (Fig. 4B). Para avaliar o papel dos AgNPs na entrada viral, realizamos o ensaio de entrada de pseudovírus baseado em luciferase. O PVP-AgNP 10 inibiu potentemente a entrada do pseudoviral, caracterizada por redução significativa da atividade da luciferase semelhante à do anticorpo neutralizante usado como controle (Fig. 4C).

Fig. 4

Características de nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com PVP na infecção por SARS-CoV-2. 4A : Imagem de imunofluorescência comparando o efeito de nanopartículas de prata de 10 nm e 100 nm contra infecção por SARS-CoV-2 em células VeroE6 / TMPRSS2. Núcleos celulares (azul) e proteína do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 no citoplasma (vermelho). NC - Controle negativo. 4B : Nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com PVP protegem células VeroE6 / TMPRSS2 da morte celular mediada por infecção por SARS-CoV-2. A coloração com violeta cristal revela proteção parcial com placas visíveis (pontas de setas vermelhas) e proteção completa com ausência de placas (pontas de setas pretas). 4C: Ensaio de entrada de pseudovírus. Nanopartículas de prata de 10 nm revestidas com PVP inibem a entrada de pseudovírus em células VeroE6 / TMPRSS2. NC - Controle negativo, nAb - Anticorpo neutralizante. (Para interpretação das referências a cores na legenda da figura, o leitor deve consultar a versão da Web deste artigo.)

5. Discussão

O Ag é há muito conhecido pelo seu efeito antimicrobiano e a propriedade antiviral dos AgNPs está sendo extensivamente pesquisada com interesse renovado no passado recente [  ]. O mecanismo exato pelo qual os AgNPs exercem seu efeito mortal sobre os vírus ainda é obscuro. No entanto, tem sido observado de forma consistente que AgNPs interagem com as proteínas estruturais na superfície dos vírus extracelulares para inibir a infecção na fase inicial, prevenindo a adesão ou entrada viral, ou danificando as proteínas de superfície para afetar a integridade estrutural dos vírions , No estudo atual, obtivemos resultados semelhantes no VPrA, onde AgNPs efetivamente inibe SARS-CoV-2 extracelular para proteger as células-alvo da infecção e o ensaio de entrada de pseudovírus revelou que AgNPs interfere na entrada viral.

Foi demonstrado que os AgNPs se ligam preferencialmente às proteínas de superfície virais ricas em grupos sulfidrila e clivam as ligações dissulfeto para desestabilizar a proteína, afetando assim a infectividade viral ,  ]. Estudos em HIV mostraram que AgNPs se associam às ligações dissulfeto que estão em estreita proximidade com o domínio de ligação de CD4 da proteína de superfície gp120 [  ]. Hati e Bhattacharyya demonstraram a importância das ligações dissulfeto na ligação da proteína spike SARS-CoV-2 com o receptor da enzima conversora de angiotensina-2 (ACE2) e cuja interrupção leva a uma ligação viral prejudicada ao receptor [ Considerando o mecanismo de ação dos AgNPs mostrado por outros autores, pode-se presumir que os AgNPs exercem seu efeito antiviral no SARS-CoV-2 ao romper as ligações dissulfeto na proteína spike e nos receptores ACE2. Outros estudos estão sendo conduzidos para encontrar o mecanismo antiviral de AgNPs no SARS-CoV-2 e elucidá-lo em detalhes posteriormente.

AgNPs também foram reivindicados por possuírem ação antiviral intracelular ao interagir com ácidos nucléicos virais [  ]. Observamos um efeito antiviral parcial no CPrA, pois houve alguma redução na carga viral nas células pré-tratadas com PVP-AgNP 10 . Embora a razão para este efeito não seja conhecida no momento, é possivelmente explicado ser devido à destruição de pontes dissulfeto no receptor ACE2 ou devido a um verdadeiro mecanismo intracelular (lá por inibir a infecção viral em série do vírus recém-produzido a partir de células infectadas a células não infectadas). Além disso, uma vez que o Ag se liga não especificamente a proteínas, seu uso como agentes antivirais também pode causar alguma disfunção celular. Mais estudos são necessários para explicar mais precisamente o efeito holístico do Ag in vivo.

Vários estudos reiteraram o efeito antiviral dependente do tamanho dos AgNPs, com partículas em torno de 10 nm de diâmetro sendo mais eficazes [  ]. Isso tem sido atribuído à maior estabilidade de interação da proteína viral alcançada por partículas de 10 nm que não é capaz por partículas maiores  ]. Consistente com isso, também observamos atividade anti -SARS-CoV-2 apenas com AgNPs de diâmetros variando de 2 a 15 nm. Nosso estudo de imunofluorescência corroborou o fenômeno acima, pois observamos que o PVP-AgNP 10 inibiu completamente o SARS-CoV-2, mas o AgNP 100 não.

AgNPs podem ser gerados por vários métodos e podem conter agentes redutores e agentes de capeamento junto com as partículas de metal [  ]. Os AgNPs revestidos ou protegidos são considerados mais vantajosos do que os AgNPs simples, pois o revestimento aumenta a estabilidade, diminui a aglomeração e reduz a citotoxicidade dos AgNPs [  ]. Entre os AgNPs revestidos, as nanopartículas protegidas por PVP são amplamente estudadas para uso biológico. Foi observado que o revestimento de PVP de AgNPs não impede sua atividade antiviral, enquanto outros agentes de revestimento o fazem [  ]. O PVP-AgNP 10 demonstrou possuir excelente atividade antiviral contra vírus com envelope, como RSV e HIV [  ,  ]. Este foi o motivo para selecionar PVP-AgNP10 para o estudo e demonstramos o efeito antiviral robusto do PVP-AgNP 10 contra SARS-CoV-2.

O efeito antiviral dos AgNPs também depende da concentração. A maioria dos estudos observou a eficácia antiviral dos AgNPs em concentrações que variam entre 10 e 100 ppm [  ]. No entanto, 0,5 ppm de cAg tem se mostrado eficaz na inibição do vírus Influenza e é a menor concentração relatada para mostrar atividade antiviral [  ]. No estudo atual, observamos que os AgNPs nus inibem o SARS-CoV-2 em concentrações que variam entre 1 e 10 ppm e se tornam citotóxicos para células de mamíferos a partir de 20 ppm e acima.

A citotoxicidade de AgNPs para células de mamíferos depende do tipo de célula e também do tipo de AgNPs. Mehrbod et al. observaram citotoxicidade em células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) com partículas de cAg nuas em concentrações superiores a 0,5 ppm [  ]. AgNPs nus com agente redutor NaBH4 foram encontrados para induzir apoptose em células de adenocarcinoma do cólon a 11 ppm, enquanto AgNPs nus estabilizados com citrato exibiram citotoxicidade em concentrações superiores a 30 ppm [  ,  ]. A este respeito, os AgNPs revestidos de PVP demonstraram ser os menos citotóxicos, sem citotoxicidade demonstrável, mesmo a 50 ppm em células epiteliais basais alveolares humanas [ Partículas menores têm um maior potencial tóxico devido à maior área de superfície de interação com a proteína ligada [  ]. Observamos esse efeito, pois o AgNP 2 mostrou citotoxicidade mesmo a 2 ppm, enquanto nenhuma das partículas maiores foi citotóxica nessa concentração. Portanto, deve-se ter cuidado quando o Ag for usado em superfícies biológicas.

Várias formulações ingeríveis e inaláveis ​​de Ag estão sendo comercializadas como cura para COVID-19, que estão disponíveis para compra no balcão. O potencial citotóxico dessas formulações deve ser considerado antes do uso pessoal. Além disso, o Ag é um microbicida de amplo espectro. O uso ilícito de Ag pode criar um desequilíbrio na microbiota comensal, levando a consequências imprevistas [  ]. AgNPs podem ser usados ​​em uma variedade de superfícies inanimadas para combater a pandemia de COVID-19 em andamento [  ]. As máscaras revestidas de Ag foram consideradas eficazes na inibição da SARS-CoV-2 e poderiam ser potencialmente eficazes quando aplicadas em filtros de ar de condicionadores de ar e dispositivos médicos [  ]. Foi comprovado que os tecidos de poliéster com incorporação de AgNP inibem a SARS-CoV-2 [ Sanitizantes e desinfetantes à base de Ag também estão sendo usados ​​para desinfecção das mãos e superfícies inanimadas, respectivamente [  ]. No entanto, o efeito dos AgNPs em influenciar a vida microbiana quando liberado no ambiente é desconhecido [  ]. Um protocolo de descarte adequado deve ser desenvolvido para produtos contendo Ag para evitar causar desequilíbrios indesejáveis ​​no padrão microbiano ambiental quando descartados após o uso.

Declaração de interesses concorrentes

Os autores não têm conflitos de interesse diretamente relevantes ao conteúdo deste artigo. YY é um funcionário atual da Kanto Chemical Co., Inc.

Reconhecimentos

O estudo foi financiado pela Agência Japonesa para Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED), número de concessão: 19fk0108110h0401 e 20he0522001j0001.

Notas de rodapé

Apêndice A Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2020.09.018 .

Apêndice A. Dados suplementares

A seguir estão os dados complementares a este artigo:

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Referências

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