quarta-feira, 9 de maio de 2018

ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA NO MODELO DE TUMOR DE ASCITE DO LINFOMA DE DALTON

ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA NO MODELO DE TUMOR DE ASCITE DO LINFOMA DE DALTON
(Enfermidade que atingiu Edson Celulari)
Muthu Irulappan Sriram , Selvaraj Barath Mani Kanth , Kalimuthu Kalishwaralal e Sangiliyandi Gurunathan
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Abstrato
A nanomedicina diz respeito ao uso de nanomateriais de engenharia de precisão para desenvolver novas modalidades terapêuticas e de diagnóstico para uso humano. O presente estudo demonstra a eficácia de nanopartículas de prata biologicamente sintetizadas (AgNPs) como um agente antitumoral usando linhas celulares de ascites de linfoma de Dalton (DLA) in vitro e in vivo. As AgNPs mostraram citotoxicidade dose-dependente contra células DLA através da ativação da enzima caspase 3, levando à indução de apoptose que foi confirmada através da fragmentação nuclear resultante. Toxicidade aguda, isto é, convulsões, hiperatividade e toxicidade crônica, como aumento do peso corporal e parâmetros hematológicos anormais, não ocorreram. As AgNPs aumentaram significativamente o tempo de sobrevivência no modelo de ratinho tumoral em cerca de 50% em comparação com os controlos do tumor. As AgNPs também diminuíram o volume de fluido ascítico em camundongos com tumor em 65%, retornando o peso corporal ao normal. A contagem elevada de leucócitos e plaquetas no fluido ascítico dos camundongos portadores de tumor foi levada para um intervalo quase normal. A análise histopatológica do líquido ascítico mostrou uma redução na contagem de células DLA em camundongos portadores de tumor tratados com AgNPs. Esses achados confirmam as propriedades antitumorais das AgNPs e sugerem que elas podem ser uma alternativa custo-efetiva no tratamento de câncer e distúrbios relacionados à angiogênese.
Palavras-chave: antitumoral, nanopartículas de prata, linfoma de Dalton, ascite
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Introdução
A nanobiotecnologia, um campo emergente da nanociência, utiliza sistemas nanobaseados para várias aplicações biomédicas. Este campo em rápido desenvolvimento da nanociência levantou a possibilidade de usar nanopartículas terapêuticas no diagnóstico e tratamento de cânceres humanos. 1 Partículas e moléculas em nanoescala são uma alternativa em potencial para o tratamento de doenças, pois elas têm efeitos biológicos únicos, baseados em sua estrutura e tamanho, que diferem dos medicamentos tradicionais de pequenas moléculas. 2 Nos últimos anos, várias empresas farmacêuticas obtiveram aprovação da Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA (FDA) para o desenvolvimento de medicamentos baseados em nanotecnologia. Espera-se que o mercado global de nanotecnologia médica atinja mais de US $ 3 bilhões nos próximos cinco anos. 3 Um relatório baseado em um estudo da European Science Foundation afirmou que há uma necessidade de grandes investimentos no desenvolvimento de novas ferramentas médicas baseadas em nanotecnologia para diagnósticos e terapias. 2
A prata era conhecida apenas como metal até o recente advento da era da nanotecnologia, quando se reconheceu que a prata poderia ser produzida na nanoescala. A prata metálica foi submetida a recentes tecnologias de engenharia, resultando em partículas ultrafinas, cujos tamanhos são medidos em nanômetros (nm) e possuem características e morfologias distintas. 4 , 5
Nanopartículas de prata (AgNPs) estão entre os nanoprodutos emergentes que ganharam crescente interesse no campo da nanomedicina devido às suas propriedades únicas e potencial terapêutico óbvio no tratamento de uma variedade de doenças, incluindo neovascularização da retina, 6 , 7 e síndrome de imunodeficiência adquirida devido a humanos vírus da imunodeficiência (HIV). 8 , 9 As AgNPs também são conhecidas pelo seu potencial antimicrobiano contra vários outros vírus, incluindo hepatite B, 10 vírus sincicial respiratório, 11 vírus herpes simplex tipo 1, 12 e vírus da varíola dos macacos. Demonstrou-se que 13 AgNPs e íons possuem atividade citotóxica intrínseca 14 , 15 e exibem um efeito antimicrobiano melhorado quando aplicados em estruturas de silício. 16 As nanopartículas de óxido de prata exibiram propriedades antitumorais em modelos de tumor de linfossarcoma Pliss transplantado quando administradas por injeção intravenosa na forma de dispersões aquosas. 17 Resultados de estudos microbiológicos indicam que a interação de íons de prata com moléculas de uma matriz lipoproteica extracelular aumenta a permeabilidade da membrana plasmática das células microbianas e, eventualmente, causa a sua morte. 18 As AgNPs são sintetizadas por meio de vários métodos físicos, químicos e biológicos. Embora os métodos químicos envolvam um procedimento muito simples, eles empregam agentes redutores químicos, como citrato, borohidreto ou outros compostos orgânicos, 19 , 20 que são tóxicos para os organismos vivos e, portanto, os tornam inadequados para uso médico, enquanto a síntese biológica ecológica envolve a formação de AgNPs por meio de redução enzimática com melhor controle sobre a forma e tamanho das nanopartículas.
AgNPs também se tornaram um componente comum em roupas, recipientes de alimentos, curativos, pomadas e revestimentos de implantes, 21 , 22 e alguns já receberam a aprovação do FDA. 23 Nanopartículas de prata inibem a angiogênese induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em células endoteliais da retina bovina. 24 Estudos semelhantes comprovaram seu efeito inibitório na permeabilidade vascular induzida por VEGF, interleucina (IL) -1β, 25 e produto final de glicação avançada 26 em células endoteliais da retina. Os potentes efeitos antiangiogênicos e antipermeabilidade das AgNPs, juntamente com sua capacidade de deter a progressão tumoral em células de linfossarcoma Pliss, levaram ao estudo do efeito antitumoral de AgNPs em tumores ascíticos.
O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos de AgNPs biologicamente sintetizados na tumorigênese de linfoma de linfoma de Dalton (DLA) sob condições in vitro e in vivo.

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materiais e métodos
Reagentes e mídia
A estreptomicina e a penicilina foram adquiridas à Calbiochem (La Jolla, CA). O soro bovino fetal (FBS) foi comprado na Sera Laboratories International Ltd (Camarillo, CA). O kit de ensaio MTT foi comprado na Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha). O kit de ensaio da caspase 3 foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO). O Meio Mínimo Essencial de Dulbeco Modificado por Ischoves (IMDM) foi adquirido à Clonetics® (Walkersville, MD). Pratos de cultura de tecidos e placas de 96 cavidades foram adquiridos à Falcon® (Franklin Lakes, NJ). Outros produtos químicos foram comprados da Sigma (St. Louis, MO), a menos que especificado de outra forma.

Linha celular
A linhagem de células DLA foi obtida do Amala Cancer Research Institute (Thrissur, Índia) e foi propagada em tumores transplantáveis na cavidade peritoneal de camundongos albinos suíços. As células recentemente aspiradas do peritônio de camundongo foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sob condições estéreis e sua concentração foi determinada usando um hemocitômetro antes do transplante. As células ascíticas coletadas assepticamente foram lavadas com meio IMDM suplementado com FBS 10%, penicilina 100 UI / mL e estreptomicina 100 mg / mL. As células DLA colhidas foram incubadas numa placa de Petri durante uma hora a 37 ° C em 5% de CO2 atmosférico, e as células não aderentes foram cultivadas e utilizadas para experiências in vitro.
Biossíntese e purificação de nanopartículas de prata
A síntese de AgNPs foi realizada com base em um método descrito em outro lugar. 27 , 28 Resumidamente, as células bacterianas foram cultivadas em caldo nutriente (100 mL) contendo extrato de carne bovina (1 g), cloreto de sódio (0,5 g) e peptona (1 g) por 24 horas. Após a incubação, as células foram colhidas por centrifugação (4000 xg, 10 minutos) e lavadas duas vezes com água destilada estéril. A síntese de AgNPs foi realizada tomando 1 g de Bacillus licheniformis úmido junto com 1 mM de AgNO 3 e fazendo a mistura de reação até 50 mL usando água desionizada em frascos de Erlenmeyer que foram então incubados em incubadora a 37 ° C por 24 horas. horas a 200 rpm.
As células dos frascos foram lavadas duas vezes com tampão fosfato 50 mM (pH 7,0) e ressuspensas em 5 mL do mesmo tampão. A ruptura ultra-sica das culas foi realizada com um processador ultrassico (Sonics Vibra Cell VC-505/220, Newtown, CT) ao longo de trs perodos de 15 segundos e com um intervalo de 45 segundos entre perodos. As amostras sonicadas foram extraídas e a solução resultante foi filtrada através de um filtro Millipore de 0,22 μm para remover os detritos celulares. As amostras sonicadas foram centrifugadas a 16.000 × g durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Caracterização de nanopartículas de prata
A caracterização das AgNPs sintetizadas e purificadas foi realizada de acordo com os métodos descritos anteriormente. 29 Amostras para análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foram preparadas em grades TEM cobertas com carbono. Medições de TEM foram realizadas em um instrumento JEOL modelo 1200EX operado a uma voltagem de aceleração de 120 kV.
Ensaio de endotoxina
O Millipore H 2 O, utilizado em todas as nossas experiências, foi testado para endotoxinas utilizando o método do coágulo de gel de acordo com as instruções do fabricante (kit de ensaio de endotoxina LAL). A formação de um coágulo de gel quando a amostra foi tratada de acordo com as instruções do fabricante do kit, indicou a presença de endotoxina. Da mesma forma, antes do tratamento em ratos, a suspensão de nanopartículas em água desionizada foi verificada quanto a possível contaminação por endotoxinas.
Determinação da concentração de nanopartículas
A determinação precisa do tamanho e concentração de nanopartículas é essencial para a aplicação biomédica de nanopartículas. 30 A concentração de AgNPs a ser administrada em um nível nM foi determinada por um método que foi relatado anteriormente. 31 O cálculo foi o seguinte:
Inicialmente, o número médio de átomos por nanopartículas foi calculado usando a fórmula:
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Onde N = número de átomos por nanopartícula, π = 3,14, ρ = densidade de prata cúbica de face centrada = 10,5 g / cm 3 , D = diâmetro médio de nanopartículas = 50 nm = 50 × 10 −7 cm, M = massa atômica de prata = 107,868 g, N A = número de átomos por mole (número de Avogadro = 6,023 x 1023). Portanto, assumindo 100% de conversão de todos os íons de prata em nanopartículas de prata:
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isto é, N = 3837233.003, então a concentração molar da solução de nanopartículas foi determinada por:
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Onde C = concentração molar da solução de nanopartículas, N T = número total de átomos de prata adicionados como AgNo 3 = 1 M, N = número de átomos por nanopartícula (do cálculo acima), V = volume da solução de reação em L, N A = número de Avogadro (6,023 × 10 23 )
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Onde C = 2,606 x 10-7 M / L = 2600 nM / 10 mL. As concentrações requeridas foram posteriormente compostas pelos valores obtidos.
Ensaio MTT
O ensaio de redução do corante de brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio foi realizado para determinar o efeito citotóxico das AgNPs em várias concentrações. O ensaio depende da redução do MTT pela desidrogenase mitocondrial, uma enzima presente nas mitocôndrias de células viáveis, para um produto azul de formazan. Resumidamente, as células DLA foram recentemente colhidas de ratinhos portadores de DLA, e a concentração de células foi ajustada para 1 x 10 5 células / mL e plaqueadas em placas de cultura de fundo plano de 96 poços com várias concentrações de AgNPs. Todas as culturas foram incubadas durante 24 horas a 37 numa incubadora humidificada. Após 24 horas de incubação (37 ° C, 5% de CO 2 em atmosfera úmida), 10 mL de MTT (5 mg / mL em PBS) foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada por mais quatro horas a 37ºC. ° C. O formazano resultante foi dissolvido em 100 mL de tampão de dissolução (fornecido como parte do kit) e a absorvância da solução foi lida a 595 nm utilizando um espectrofotómetro Multiwell de varrimento (Biorad, Modelo 680, Japão). Todas as determinações foram realizadas em triplicado. As concentrações de AgNPs mostrando uma redução de 50% na viabilidade celular (isto é, valores IC50) foram então calculadas.
Ensaio Caspase 3
As células foram lisadas com o tampão de lise fornecido no kit de ensaio de caspase 3 (Sigma, St. Louis, MO) e mantidas em gelo durante 15 a 20 minutos. O ensaio baseia-se na hidrólise do substrato peptídico, Ac-DEVD-pNA, pela caspase 3, resultando na libertação de Ac-DEVD e p nitroanilina (pNA) que absorvem luz significativamente a 450 nm. Resumidamente, para 1 mL da mistura reaccional, foram adicionados 10 mL do lisado celular de amostras tratadas juntamente com 980 mL de tampão de ensaio, seguido pela adição de 10 mL de substrato colorimétrico caspase 3 20 mM (Ac-DEVD pNA). Os lisados celulares das culas DLA tratadas com AgNP foram ent incubados a 37 com o substrato de caspase 3 durante duas horas e a absorvcia foi lida a 450 nm num espectrofotetro de ultravioleta Vis de feixe duplo (Shimadzu, Jap). O ensaio também foi realizado com células não induzidas e na presença de inibidor de caspase 3 para uma análise comparativa.
Ensaio de fragmentação de DNA
1 x IO6 células foram lisadas em 250 uL de tampão de lise celular contendo Tris HCl 50 mM, pH 8,0, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM, NaCl 0,1 M e dodecil sulfato de sódio a 0,5%. O lisado foi incubado com 0,5 mg / mL de RNase A a 37 durante uma hora e depois com 0,2 mg / mL de proteinase K a 50 durante a noite. A extração de fenol desta mistura foi realizada e o DNA na fase aquosa foi precipitado em 25 μL (1/10 volume) de acetato de amônio 7,5 M e 250 μL (1/1 volume) de isopropanol. A eletroforese de DNA foi realizada em gel de agarose a 1% contendo 1 μg / mL de brometo de etídio a 70 V, e os fragmentos de DNA foram visualizados expondo o gel à luz ultravioleta, seguido da fotografia.
Manutenção de animais e transplante de tumores
Os estudos in vivo foram realizados em fêmeas de camundongos albinos suíços com idade entre 5 e 6 semanas, pesando 25 ± 5 ge alojados em gaiolas de policarbonato (cinco ratos por gaiola) a uma temperatura ambiente de 25 ± 2 ° C com uma luz de 12 horas. e ciclo escuro de 12 horas. Os camundongos foram alimentados com ração de roedores comercialmente obtida e água ad libitum . Permitiu-se que os animais se aclimatassem ao ambiente de laboratório e foram aleatoriamente sujeitos ao experimento. Todos os experimentos foram conduzidos conforme as diretrizes do comitê institucional de ética animal (509/01 / c / CPCSEA) e tiveram aprovação prévia do mesmo comitê. As linhagens de células DLA foram mantidas em modelos de camundongos por transplante seriado asséptico em camundongos albinos suíços de camundongos portadores de tumor após o décimo dia de indução de ascites.
Design experimental
Os camundongos foram divididos em quatro grupos, com seis animais em cada grupo: Grupo 1, camundongos não tumorais em branco (não tumorais, não tratados); Grupo 2, ratinhos de controlo de tumores (induzidos por tumores, n tratados); Grupo 3, camundongos induzidos por tumor tratados com AgNPs a uma concentração de 500 nM em solução aquosa via injeção intraperitoneal (IP) por 15 dias; e o grupo 4, ratos de controlo tratados com AgNP a uma concentrao de 500 nM.
Efeito de nanopartículas de prata no tumor ascítico
A concentração inibitória mínima (IC50) determinada pelo ensaio de MTT foi utilizada para as experiências in vivo. O AgNP entregue aos ratos foi realizado utilizando o IC50 obtido. Ratinhos tumorais no Grupo 3 foram tratados com AgNPs a uma concentração de 500 nM durante um período de 15 dias, e a sua capacidade para reduzir o volume do tumor e o número de células foi comparada com ratinhos de controlo de tumores do Grupo 2.
Determinação do tempo médio de sobrevivência e aumento percentual no tempo de vida
Os animais foram inoculados com 1 x 106 culas / ratinho no dia 0 e o tratamento com AgNPs comeu 24 horas ap o transplante. O grupo controle foi tratado com o mesmo volume de solução de NaCl a 0,9%. Todos os tratamentos foram administrados por 15 dias. O tempo médio de sobrevivência (MST) de cada grupo, consistindo de seis camundongos, foi anotado. A eficiência antitumoral das AgNPs foi comparada com a de 5-fluorouracil (Dabur Pharmaceuticals, Índia) 20 mg / kg / dia IP durante nove dias. O MST dos grupos tratados foi comparado com o grupo controle usando o seguinte cálculo:
Aumento da expectativa de vida = (T - C / C) × 100
onde T = número de dias que os animais tratados sobreviveram e C = número de dias que os animais de controlo sobreviveram.
Eutanásia de animais experimentais
Após a conclusão do tratamento experimental, todos os ratos foram privados de comida durante a noite e eutanasiados por deslocamento cervical sob anestesia com cetamina-xilazina. O líquido ascítico e amostras de sangue foram coletadas cuidadosamente para várias estimativas histológicas e hematológicas, respectivamente.
Análise hematológica
Amostras de sangue foram coletadas por punção intracardíaca após anestesia com cetamina-xilazina. O sangue total foi imediatamente coletado em frascos revestidos com etilenodiaminotetracético para exame de potencial toxicidade hematológica. A análise hematológica incluiu a determinação dos níveis de glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e plaquetas, e medição da concentração e volume de hemoglobina corpuscular média utilizando um analisador hematológico automático (MS9 Differential Cell Counter 3 Part, HD Consortium, Índia).
Análise histológica
O líquido ascítico desempenha um papel crucial no DLA e é uma coleção de células pleomórficas com núcleos hipercromáticos que são aglomerados de células malignas. A viabilidade de células tumorais no fluido ascítico pode levar a um agravamento adicional da doença e, portanto, a morfologia e o número de células no fluido ascítico dos controles e camundongos tratados com tumor foram observados por análise histológica. O líquido ascítico foi cuidadosamente coletado dos dois grupos experimentais (Grupo 2 e Grupo 3) e fixado em uma concentração de 1 mL usando uma solução tampão de formalina neutra a 10%, embebida em parafina e cortada em seções de 5 μm de espessura. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina, examinados ao microscópio de luz e fotomicrografias obtidas.
Análise estatística
Os valores foram expressos como média ± desvio padrão (DP). A significcia estattica (5%) foi avaliada por anise de varicia de uma via (ANOVA) seguida pelo teste t de Student ( P <0,05, Graph Pad, San Diego, CA).
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