quarta-feira, 9 de maio de 2018

Atividade Citotóxica de Nanopartículas de Prata e Íons de Prata em Células de Câncer de Mama Humanas T47D Resistentes a Parentes e Tamoxifeno e seus Efeitos Combinados com Tamoxifeno contra Células Resistentes



Abstrato

Estudos sobre aplicações biomédicas de nanopartículas estão crescendo com um ritmo acelerado. Na medicina, as nanopartículas podem ser a solução para a resistência a múltiplas drogas, que ainda é uma grande desvantagem na quimioterapia do câncer. No presente estudo, investigamos o potencial efeito citotóxico de nanopartículas de prata (Ag NPs) e íons de prata (Ag + ) em células T47D resistentes ao pai e ao tamoxifeno na presença e ausência de tamoxifeno. Ags NPs foram sintetizadas (<28 nm ) e o ensaio MTT foi realizado. Os valores de IC50 associados foram: 6,31 µg / ml para Ag NPs / células parentes, 37,06 µg / ml para Ag NPs / células resistentes ao tamoxifeno, 33,06 µg / ml para Ag + / células-mãe e 10,10 µg / ml para Ag + / células resistentes. Como uma experiência separada, o efeito de concentrações sub-inibitórias de Ag NP e Ag + na proliferação de células resistentes ao tamoxifeno foi avaliado em concentrações não tóxicas de tamoxifeno. Nossos resultados sugerem que, em concentrações não citotóxicas de nanomateriais de prata e tamoxifeno, as combinações de Ag + -tamoxifeno e Ag NPs-tamoxifeno ainda são citotóxicas. Esse achado pode ser de grande benefício potencial na quimioterapia do câncer de mama; já que doses muito menores de tamoxifeno podem ser necessárias para produzir o mesmo efeito citotóxico e os efeitos colaterais serão reduzidos.

Palavras-chave: Neoplasias mamárias, Quimioterapia, Citotoxicidade, Nanopartículas, Tamoxifeno
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Introdução
Os últimos anos testemunharam uma crescente atenção para o rápido desenvolvimento de todos os aspectos do que é chamado de “nanotecnologia”. A nanotecnologia é brevemente denominada “A capacidade de fabricar, caracterizar e manipular estruturas artificiais, cujas características são controladas ao nível nanométrico” ( 1 ). Isso pode envolver projeto, síntese e preparação de nanopartículas para criar produtos com novas propriedades ( 2 - 4 ). Nos últimos anos, tem havido muito interesse na aplicação de nanomateriais para fins biológicos. Esses materiais incluem nanopartículas ( 5 - 7 ), nanotubos ( 8 ), nanofios ( 9 ) e pontos quânticos ( 10 ). No entanto, as aplicações biomédicas de nanomateriais como agentes citotóxicos ou antimicrobianos, biossensores e carreadores de fármacos estão crescendo em ritmo acelerado ( 11 - 13 ).

Apesar de muitos esforços, a resistência a múltiplas drogas ainda é considerada uma grande desvantagem na quimioterapia do câncer, que tem sido objeto de experimentos exaustivos nessa área ( 14 ). Os mecanismos celulares subjacentes a esse fenômeno são bem discutidos anteriormente ( 15 ). Também é bem conhecido que um dos principais mecanismos subjacentes à resistência a drogas é baseado na expressão do gene MDR-1 que leva à formação de proteínas transportadoras de ABC ligadas à membrana, tais como as glicoproteínas-P ( 16 , 17 ). Mecanismos alternativos incluem processos de desintoxicação por enzimas do metabolismo do citocromo P450 e glutationa, mecanismos de reparo celular que reparam danos no DNA induzidos por drogas, e alteração de vias de sinalização apoptótica, de modo que as células poderiam resistir à apoptose induzida por drogas.

O tamoxifeno é um medicamento freqüentemente prescrito, amplamente utilizado em todos os estágios do câncer de mama ( 18 ). No entanto, a resistência ao tamoxifeno ainda é um grande problema que limita sua aplicação na quimioterapia do câncer de mama ( 19 , 20 ). De modo a reduzir a resistência ao tamoxifeno, foram feitos esforços prodigiosos em terapias de combinação de tamoxifeno e compostos diferentes, tais como o activador de junções de hiato ( 21 ). A terapia combinada de drogas e nanopartículas é promissora, uma vez que pode melhorar a penetração de drogas nas células tumorais, melhorar sua capacidade de direcionamento de tumores e reduzir seus efeitos colaterais ( 22 ). Recentemente, o efeito citotóxico de nanopartículas poliméricas carregadas com tamoxifeno foi investigado por Amiji e colaboradores ( 23 ).

As aplicações biológicas de nanopartículas de prata (Ag NPs) têm sido amplamente estudadas; propriedades antimicrobianas em particular ( 24 - 27 ). Sabe-se que as NPs ag são citotóxicas tanto para células normais como para células cancerígenas em mamíferos ( 28 ) e os modos de interacção de Ag NP foram investigados em diferentes sistemas procarióticos e eucarióticos ( 29 - 31 ). Os efeitos citotóxicos dos íons de prata (Ag + ) também foram relatados em diferentes linhagens celulares ( 32 , 33 ). No entanto, nenhuma expericia comparativa foi ainda realizada sobre os efeitos citoticos da combinao de nanomateriais de prata e tamoxifeno em linhas celulares de cancro. Além disso, juntamente com os promissores efeitos citotóxicos dos nanomateriais de prata, ultimamente tem sido levantada muita preocupação sobre a questão da segurança desses compostos devido aos efeitos tóxicos indesejáveis ​​dos NPs de Ag tanto na saúde humana quanto no meio ambiente ( 34 , 35 ).

Este estudo representa uma avaliação comparativa in vitro do efeito de Ag NPs e Ag + na viabilidade de dois subtipos de células; Linhagem celular de câncer de mama T47D humano e linhagem celular T47D resistente ao tamoxifeno. Além disso, o efeito citotóxico de concentrações sub-inibitórias de Ag NPs e Ag + em células resistentes ao tamoxifeno tanto na presença como na ausência de tamoxifeno foi investigado.

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Materiais e métodos
Materiais
RPMI-1640 e soro bovino fetal foram adquiridos da Gibco (Estados Unidos); Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT), tamoxifeno, penicilina e estreptomicina da Sigma (Reino Unido); e dextrose, nitrato de prata (AgNO3), hidróxido de sódio (NaOH), cloreto de hidrogénio (HC1) e isopropanol da Merck (Alemanha).

Síntese de NPs Ag
A redução química de uma solução aquosa de AgNO 3 é um dos métodos mais amplamente utilizados para a síntese de colóides Ag ( 36 ). Preparou-se uma solução aquosa contendo Ag + 0,5 mM adicionando 22,5 mg de dextrose a 100 ml de solução de AgNO3 (0,5 mM ). Esta soluo foi depois alcalinizada utilizando 20 de NaOH 0,1 N e tratada num forno de microondas durante 60 segundos para induzir a reduo de is meticos. A redução do Ag + por dextrose na solução foi monitorizada por amostragem do componente aquoso (2 ml ) e depois medindo os espectros ultravioleta-visíveis (UV-Vis) das soluções num espectrofotómetro de varrimento automático UV-Vis de feixe duplo (Labomed, Inc., Spectro UV-Vis Double PC, Modelo UVD-2950), operado a uma resolução de 2 nm . Além disso, as NPs de Ag foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) (pistola de emissão de campo Phillips CM200) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS). Para esta proposta, uma suspensão aquosa contendo os Ag NPs foi dispersa ultrasonicamente, e uma gota da suspensão foi colocada em redes TEM de cobre revestidas com carbono e seca sob uma lâmpada IR. Micrografias foram obtidas usando um TEM operado a uma voltagem de aceleração de 80 kV .

Linha celular e condições de cultura
A linhagem de células de câncer de mama humano T47D (ATCC HTB-133, Estados Unidos) foi comprada do National Cell Bank of Iran (Instituto Pasteur do Irã, Teerã, Irã). A sub-linha da linhagem celular de câncer de mama humano T47D resistente ao tamoxifeno foi oferecida pelo Laboratório de Pesquisa Molecular, Departamento de Farmacologia e Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade de Ciências Médicas de Teerã (Teerã, Irã) ( 37 ). A linha celular de cancro parental foi mantida em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U / ml de penicilina e 100 µg / ml de estreptomicina numa incubadora de células a 5% de dióxido de carbono (CO2) a 37ºC. A linha celular de cancro resistente ao tamoxifeno foi cultivada no meio descrito suplementado com 1 µM de tamoxifeno e mantida sob as mesmas condições de células cancerígenas progenitoras.

Ensaio de citotoxicidade
O ensaio baseado em MTT foi realizado de acordo com um método previamente descrito ( 38 ) por semeadura preliminar de 45.000 células cancerígenas num meio de crescimento de 100 µl na presença de concentrações crescentes de Ag NPs e Ag + (15, 20, 30, 40 , 45 e 50 / mL ) em placas de 96 pos, individualmente e subsequente incubao de culas a 37 em 5% de CO2 durante 48 h . As culas foram depois tratadas com 25 de MTT (5 mg / mL ) e incubadas a 37 durante 4 h . Células não tratadas foram usadas como controle. Após a dissolução dos cristais de formazano em HCl 0,04 N em isopropanol, as placas de 96 poços foram lidas num leitor de microplacas (Dynatech Laboratories, Inc, Estados Unidos) a 570 nm . Cada expericia foi repetida tr vezes e o ensaio MTT foi realizado em triplicado para cada expericia. A citotoxicidade foi calculada como a percentagem de culas vieis em diferentes concentraes de amostras relativamente culas de controlo (n tratadas). Também, a Concentração Inibitória Meia Máxima (IC50) foi calculada como a concentração requerida inibindo o crescimento de células tumorais em cultura em 50% em comparação com as células não tratadas.

Como uma experiência separada, o efeito de combinação de Ag NPs e Ag + foi estudado tanto na presença como na ausência de tamoxifeno, em células T47D resistentes ao tamoxifeno. As concentra�es sub-inibit�ias de Ag NP (2,5 � / mL ) e Ag + (1,5 � / mL ) foram determinadas por um ensaio preliminar de MTT em linhas celulares testadas. Os efeitos destas amostras foram investigados nas concentrações mencionadas acima sobre a proliferação de células T47D resistentes ao tamoxifeno cultivadas em ambos os meios de cultura contendo tamoxifeno (1 µM ) e sem tamoxifeno e a proliferação de células neste meio de cultura foi avaliada em diferentes intervalos de tempo de incubação (20, 40, 60, 80 e 100 horas ), utilizando o mesmo ensaio MTT, descrito anteriormente.

análise estatística
As diferenças na citotoxicidade celular foram comparadas usando o teste t de Student. Os valores de p <0,05 foram considerados significativos.

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Resultados
Síntese de nanopartículas de prata e sua caracterização
Neste estudo, os NPs Ag foram sintetizados utilizando o método de redução química descrito anteriormente ( 36 ). Os Ag NPs sintetizados foram subsequentemente caracterizados por espectroscopia UV-Vis ( Figura 1 ). Vale ressaltar que a técnica descrita acima, mostrou-se muito útil na análise de nanopartículas. Como ilustrado na Figura 1 , a forte banda de absorção com um máximo localizado a 420 nm foi causada pela formação de Ag NPs produzidos pela dextrose. Este pico é atribuído ao fenômeno plasmônico de superfície, que é bem identificado em várias nanopartículas metálicas com tamanhos variando de 2 nm a 100 nm ( 39 , 40 ). A inserção na Figura 1 é uma fotografia de colóides Ag preparados conforme.

Continue em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3558162/

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