quinta-feira, 21 de fevereiro de 2019

OURO MONOATÔMICO NÃO É OURO COLOIDAL

As pessoas tendem a confundir um com o outro, mas não são iguais

O ouro coloidal é uma solução de coloides feita como uso de uma fonte elétrica adequada, sais em soluções especificas, eletrodo de ouro 24 quilates num processo de eletrólise.

O ouro monoatômico é chamado de orme (“Orbitally Rearranged Monoatomic Elements”) ou ormu, é feito por um processo complexo o ouro derrete a a altas temperaturas, misturado a ácidos entre outras substâncias.

O Sr. Hudson é constantemente citado quando se fala de ouro monoatômico e ORMUS em geral, e teria sido ele o criador do termo “Orbitally Rearranged Monoatomic Elements” (ORME).
Hudson era agricultor e na década de 1970 começou a fazer pesquisas com amostras de minerais e solo em sua própria fazenda, acabando por dedicar muito tempo e dinheiro a essa atividade. Como não tinha formação acadêmica convencional, criou suas próprias "teorias" para explicar os diversos resultados que foi observando durante seus experimentos que duraram muitos anos.

Em suas palestras, Hudson fez declarações incríveis como esta (da Referência [24]) :

”Keep in mind that the Soviet Academy of Sciences, the most prestigious scientific body in the Soviet Union and Johnson-Mathewe- Inglehart produce all the precious metals in the world. The mining activity of the best deposit in the world in South Africa for six of these elements (Pd, Pt, Os, Ru, Ir, and Rh -- i.e. no silver or gold) may yield only one-third of one ounce of the precious metals per ton of ore. They go a half mile down into the ground, following an 18 inch seam of material, to get 1/3 of 1 oz per ton of all the precious elements. No one else knows it’s there, and no one can analyze it. We, on the other hand, are able to derive and identify out of one ton of ore: 6-8 ounces of Palladium, 12-13 ounces of Platinum, 150 ounces of Osmium, 250 ounces of Ruthenium, 600 ounces of Iridium, and 1200 ounces of Rhodium!!”

Isto é, ele alegou que com seu método poderia extrair 6.663 vezes mais paládio, platina, ósmio, rutênio, irídio e ródio, do minério do que se consegue pelos meios convencionais. De uma tonelada de minério, ele extrairia 62,94 quilos destes metais preciosos, em lugar das 9,45 gramas obtidas normalmente !!!!!

Registrou patentes de suas descobertas em vários países, e aqui você pode examinar a patente inglesa de 1989. Logo no início, Hudson esclarece que sua invenção permite separar a forma monoatômica de certos elementos metálicos, deste modo possibilitando obter metais no estado-m a partir de sua forma comercial :
”This invention relates to the monoatomic forms of certain transition and noble metal elements, namely, gold, silver, copper, cobalt, nickel and the six platinum group elements. More particularly, this invention relates to the separation of the aforesaid transition and noble metal elements from naturally occurring materials in their orbitally rearranged monoatomic forms, and to the preparation of the aforesaid transition and noble metal elements in their orbitally rearranged monoatomic forms from their commercial metallic forms. The materials of this invention are stable, substantially pure, non-metallic-like forms of the aforesaid transition and noble metal elements, and have a hereto unknown electron orbital rearrangement in the "d", "s", and vacant "p" orbitals. The electron rearrangement bestows upon the monoatomic elements unique electronic, chemical, magnetic, and physical properties which have commercial application.”

A patente inclui um procedimento de 21 etapas para a obtenção de ouro monoatômico (G-ORME) na forma de um pó branco. A complexidade do procedimento ressalta o ridículo dos métodos caseiros para obtenção de G-ORME que circulam na Internet.

Dessa forma, para obter o ouro monoatômico verdadeiro é necessário um aparato de laboratório com equipamentos capazes de elevar o ouro a altas temperaturas.

Cuidado como que você compra e cuidado com a confusão.

Leia mais sobre:

http://www.conhecimentohoje.com.br/Ouro_Monoatomico.htm

https://pt.slideshare.net/talmidinsanto/manual-de-fabricao-de-ouro-monoatmico-ormes-ormus-pedra-filosofal-mana-patente-david-hudson

PRATA COLOIDAL E REAÇÃO DE JARISCH-HERXHEIMER

VOCÊ SABIA QUE DEVE TOMAR PRATA COLOIDAL AUMENTANDO AOS POUCOS POR CAUSA DA REAÇÃO DE JARISCH-HERXHEIMER?
Qualquer um que experimente a prata coloidal em qualquer período de tempo terá de compreender a reação de Jarisch-Herxheimer (ou reação Herxheimer).
A prata é eficaz como um eliminador de bactérias, fungos e leveduras e um controlador de vírus, mas uma pessoa muito seriamente doente pode sofrer de uma reação causada pela libertação de toxinas, causada pela morte em larga escala desses agentes patogênicos.
Embora este seja um processo normal e não a causa, normalmente, quaisquer problemas evidentes para a pessoa que faz o tratamento com a prata coloidal, por vezes, o agente patogênico que morre é tão grave que a pessoa começa a sentir mais do que a indisposição e desconforto inicial da doença, achando que é devido à doença.
Quando uma pessoa está tomando a Prata Coloidal ou CS, pela primeira vez, pode também haver um efeito a partir da mortandade de muitos milhões de bactérias (normalmente inofensivos) dentro do corpo.
É necessário criar um novo usuário da Prata Coloidal, consciente deste efeito, para que eles entendam que esta é uma parte normal do processo de cura, e não ver isso erroneamente como sendo causado diretamente pelo uso da prata.
O Herxheimer é normalmente de curta duração e pode ser considerado como uma forma de desintoxicação pelo organismo, e o corpo pode apresentar sintomas semelhantes aos da gripe; leve a moderada febre, dor de cabeça, dor nas articulações e músculos, dores no corpo, dor de garganta, mal-estar geral, sudorese, calafrios e náuseas.
A pele, sendo um órgão excretor, o 3º maior do corpo humano, conhecido para a eliminação de venenos e toxinas, também pode mostrar manchas exageradas ou coceira.
Assemelha-se a definição médica de sepse (que não é de surpreender) e também pode acontecer depois de uma prescrição de antibióticos, como a penicilina ou tetraciclina(de novo, surpreendente).
Fontes sobre o estudo na Internet diz que a reação de Herxheimer é particularmente comum durante o tratamento de febre recorrente, sífilis, doença de Lyme, leptospirose, brucelose, febre tifoide, e triquinose; em particular, qualquer doença que envolve espiroqueta bactérias.
Se essa reação é particularmente grave, os médicos podem prescrever medicamentos anti-inflamatórios, a cada quatro horas durante vários dias, ou corticoides como a prednisona. Os doentes devem ser cuidadosamente monitorizados em caso dessa reação em doenças graves, seja com a prata ou antibióticos tradicionais, ficando alerta para o colapso e choque potencial. Em casos extremos, meptazinol, podem ser prescritos.
A reação de Herxheimer é uma reação perfeitamente normal que mostra que a Prata Coloidal está destruindo os patógenos. A Prata não diretamente, causa a reação de Herxheimer em PACIENTES GRAVES.
ATENÇÃO
Assim, qualquer pessoa que sofre deste efeito deve tentar manter o consumo de Prata Coloidal a uma dose mais baixa ou parar por alguns dias e, em seguida, reiniciar a dosagem de menor para maior.
A prata Coloidal Não é tóxica e deve-se ressaltar que a maioria das pessoas nunca experimentou a reação de Herxheimer.
O único "tratamento" mais eficaz para a reação de Herxheimer é água potável.
Todos os usuários de prata coloidal devem manter uma alta ingestão de fluidos e água em particular.
Se esta reação acontecer, então é melhor para aguentar o processo de desintoxicação, se possível, mesmo que tenha de ser feito por fases através da redução da ingestão (volume e frequência) de Prata Coloidal, tal como o é a limpeza corporal. Esta reação é um sinal que a carga parasitária é particularmente alta e a infecção ou outra é grave.
Um sintoma realmente grave é batimento cardíaco irregular, dificuldades respiratórias ou tossir tão grave que a pessoa não pode "recuperar o fôlego" ou inchaço significativo na garganta, nesse caso deve ser dada atenção médica imediata.
Resumindo, a reação de Herxheimer é causada pelo excesso de patogênese morto no organismo de uma única vez, onde o organismo não consegue eliminá-los em tempo hábil, ocorrendo uma intoxicação pelos micro-organismos mortos. Por isso, tanto com antibióticos, quanto com a prata é necessário avaliar a dosagem para que inicie gradativamente no caso de doenças graves.
Dessa forma, entenda que ingerir muito ou "mais forte" para resolver logo, pode te causar inúmeros desconfortos. Siga a norma do EPA.

quinta-feira, 7 de fevereiro de 2019

Nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico demonstram atividade antiviral na infecção por vírus herpes simplex tipo 2

Nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico demonstram atividade antiviral na infecção por vírus herpes simplex tipo 2


A interação entre nanopartículas de prata e herpesvírus está atraindo grande interesse devido à sua atividade antiviral e possibilidade de uso como microbicidas para herpes oral e anogenital.

Neste trabalho, nós demonstramos que nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico de 13 nm, 33 nm e 46 nm são capazes de reduzir a infecciosidade do HSV-2 tanto in vitro quanto in vivo . A atividade antiviral das nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico estava relacionada com o tamanho, requeria interação direta e bloqueava a ligação do vírus, a penetração e a disseminação adicional. Todas as nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico testadas reduziram tanto a infecção quanto a reação inflamatória no modelo de camundongo da infecção pelo HSV-2 quando usadas na infecção ou para um tratamento pós-infecção.

Nanopartículas de menor tamanho induzem a produção de citocinas e quimiocinas importantes para a resposta anti-viral. Os tampões de controlo correspondentes com ácido tânico apresentaram efeitos antivirais inferiores in vitro e foram ineficazes no bloqueio da infecção in vivo . Nossos resultados mostram que as nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico são boas candidatas para microbicidas utilizados no tratamento de infecções por herpesvírus.

INTRODUÇÃO

O vírus herpes simplex (HSV) causa uma infecção contagiosa que afeta aproximadamente 60% a 95% dos adultos em todo o mundo. O HSV-1 está associado principalmente a infecções da boca, faringe, face, olhos e sistema nervoso central (SNC), enquanto o HSV-2 causa infecções na área anogenital [1] - [4] . Na maioria dos indivíduos infectados, o HSV estabelece latência nos gânglios neurais, onde pode ser reativado causando doença recorrente [1] - [4] . A infecção genital por HSV-2 é mais comum em mulheres do que em homens. Portanto, podemos supor que as ulcerações resultantes da infecção recorrente por HSV-2 consistem em um dos fatores mais comuns que influenciam a integridade e o funcionamento da mucosa vaginal [4] , [5] . No momento, existem muitas vacinas experimentais anti-HSV-1 e anti-HSV-2, mas nenhuma delas foi introduzida no tratamento de infecções por herpes.

Taninos são definidos como de alto peso molecular (500 a 4000 Da), metabólitos secundários polifenólicos de plantas vasculares acumulados em folhas e frutos [6] , [7] . Estes polifenóis são capazes de formar complexos insolúveis com proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e quelar íons metálicos. O ácido tânico (penta- m- glicoil glicose) é o tanino hidrolisável mais simples e principal. As propriedades antioxidantes, anticancerígenas e antimicrobianas do ácido tânico foram relatadas [8] - [14] . Lin et al. (2011) mostraram que os taninos hidrolisáveis ​​isolados de frutos de Terminalia chebula interagem com as glicoproteínas do HSV-1 para prevenir a adesão, a entrada e a disseminação célula-a-célula [15] .

As propriedades antibacterianas e antifúngicas das nanopartículas de prata (AgNPs) têm sido amplamente estudadas [16] - [18] . Recentemente, foram relatadas propriedades antivirais de AgNPs durante estudos in vitro com HIV-1 [19] , [20] , HBV [21] e vírus influenza [22] . Lara et al. (2010) mostraram que as AgNPs podem se ligar a uma das glicoproteínas de superfície do HIV (gp120) e inibir a ligação vírus-célula [20] . Baram-Pinto et al. (2009) utilizaram AgNPs cobertos com sulfonato de mercaptoetano para inibir a ligação do HSV-1 à membrana da célula hospedeira e, portanto, à infecção [23] .

A maioria das drogas anti-herpes tem como alvo a DNA polimerase viral e inclui análogos de nucleosídeos ou pirofosfatos. O aciclovir (ACV), um análogo de guanosina, tem sido o fármaco clínico mais importante para o tratamento profilático ou terapêutico de infecções por HSV e representa o padrão ouro para a terapia anti-HSV [24] . No entanto, o uso extensivo desta droga levou ao surgimento de cepas de vírus resistentes ao ACV, particularmente em pacientes imunocomprometidos [25] , [26] . As infecções recorrentes por herpes consistem em um problema particular em pessoas com imunodeficiências, como pacientes com neoplasias malignas ou pessoas infectadas pelo HIV [27] , [28] . Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um microbicida anti-herpesviral eficaz.

O presente estudo indica que, por bloqueio direto da ligação e penetração viral, as nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico apresentam boas propriedades antivirais tanto in vitro como in vivo . A indução de citocinas antivirais e a produção de quimiocinas por AgNPs modificadas com ácido tânico, juntamente com a diminuição da reação inflamatória in vivo, sugerem que sua atividade não está restrita à inativação do vírus. Ao todo, mostramos que as nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico consistem em um potencial microbicida para infecção por herpesvírus nos tecidos da mucosa.

Materiais e métodos

Declaração de ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Acto Polaco de 21 de Janeiro de 2005 sobre experiências com animais (JO nº 33, item 289) e com a Directiva 2010/63 / CE do Parlamento Europeu e do Conselho de 22 de Setembro de 2010. protecção dos animais utilizados para fins científicos. O protocolo foi aprovado pelo 3º Comitê Local sobre Ética de Experimentação Animal em Varsóvia, Polônia (Número de Autorização: 35/2011).

Nanopartículas

Todas as nanopartículas utilizadas neste estudo foram sintetizadas pelo método de redução química utilizando pureza de nitrato de prata (AgNO 3 ) 99,999% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), citrato de sódio (C 6 H 5 Na 3 O 7 * 2H 2 O) pureza 99,0%, (Sigma-Aldrich), ácido tânico (C 76 H 52 O 46 ) (Sigma-Aldrich) e boro-hidreto de sódio (NaBH 4 , pureza ≥ 96%) (Sigma-Aldrich). Detalhes do método de síntese foram descritos anteriormente [29] .
Resumidamente, agnicos de 13 nm foram preparados como se segue: em 95,5 g da soluo aquosa de nitrato de prata na concentrao de 0,017%, colocada num agitador mecico, uma mistura de citrato de sio (4,2 g, 4%) e ido tico (0,6 g , 5%) foi adicionado. Depois de misturar os reagentes adicionou-se 0,7 g de solução de boro-hidreto de sódio, na concentração de 2%. Após a adição de cor redutores mudaram para marrom. A reacção foi realizada durante 15 minutos à temperatura ambiente, o valor final do pH foi de 7,9 e o volume total de colóide foi igual a 100 ml.
Prepararam-se AgNPs a 33 nm da seguinte forma: aqueceu-se uma solução aquosa de AgNO3 (95,2 g, 0,017%) para ferver e agitou-se ao refluxo. Em seguida, adicionou-se a mistura de solução aquosa de citrato de sódio (4,2 g, 4%) e uma solução aquosa de ácido tânico (0,6 g, 5%). Imediatamente após a adição de redutores, a cor da solução mudou para amarelo, o que indica a formação de nanopartículas de prata. A solução foi vigorosamente agitada sob refluxo durante 15 min adicionais e depois arrefecida até à temperatura ambiente. O valor final do pH foi de 6,7 e o volume total de colóide foi igual a 100 ml.
Foram preparadas AgNPs a 46 nm como descrito acima mas com a diferente quantidade de nitrato de prata (98,4 g, 0,016%), citrato de sódio (1,0 g, 4%) e ácido tânico (0,6 g, 5%). As AgNPs sem ácido tânico (10-65 nm AgNPs) foram preparadas como se segue: uma solução aquosa de AgNO3 (99,0 g, 0,0051%) foi aquecida para ferver e agitada sob refluxo. Em seguida, adicionou-se solução aquosa de citrato de sódio (1,0 g, 4%). Após a adição de redutores, a cor da solução mudou para amarelo, o que indicou a formação de nanopartículas de prata. A solução foi vigorosamente agitada sob refluxo durante 15 min adicionais e depois arrefecida até à temperatura ambiente. O valor final do pH foi de 5,7 e o volume total de colóide foi igual a 100 ml. Deve-se notar que o pH do colóide de prata e do meio biológico foi desminado pelo próprio meio para cada síntese.
Colóides de prata sintetizados foram examinados usando uma técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). A distribuição de tamanho e tamanho das partículas nos colóides foi medida usando um sistema zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Os parâmetros medidos foram os seguintes: um comprimento de onda do laser de 633 nm (He-Ne), um ângulo de dispersão de 173 °, uma temperatura de medição de 25 ° C, uma viscosidade média de 0,8872 mPa * s e um índice médio de refração de 1,330 . As amostras foram carregadas em microcuvette de quartzo e cinco medições foram realizadas, para as quais o resultado médio foi registrado.

Vírus

A cepa HSV-2 333 [30] foi obtida de B. Adamiak, Departamento de Virologia Clínica, Universidade de Göteborg, Göteborg, Suécia e propagada em células de rim de macaco verde africano (GMK-AH1) e titulada pelo ensaio padrão de placa (PFU / ml) [31] .

Linhas de celular

Células de rim de macaco verde africano (GMK-AH1) foram doadas pelo Instituto Sueco de Controle de Doenças Infecciosas, Estocolmo [32] , células 291.03C de queratinócitos de camundongo foram gentilmente cedidas por M. Kulesz-Martin (Departamento de Dermatologia, Oregon Health and Science). University, Portland, OR, EUA) [33] . As células foram cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle com modificação alfa (α-MEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, (HI-FCS), 1% L-glutamina, penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 µg / ml) (Gibco por Life Sciences Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Células 291.03C foram também suplementadas com 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico de ratinho (EGF) (Sigma-Aldrich).

Imagens TEM e SEM

As imagens TEM de nanopartículas foram adquiridas como descrito anteriormente [29] . Imagens de microscopia eletrônica de varredura da interação HSV-2 com AgNPs foram obtidas incubando a preparação de HSV-2 (10 5 PFU / ml) com 10 µg / ml de AgNPs modificados por ácido tânico por 30 minutos, então a mistura foi adicionada a 291.03C incubados por 60 minutos e fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2 por 20 min, conforme descrito em [34] e adquiridos utilizando FE-SEM Merlin (Zeiss, Jena, Alemanha). A anise elementar foi realizada com um dispositivo EDS multicanal XFlash Detector 5010 125 eV, Quantax Bruker (Alemanha) utilizando energia de feixe de electrs de 15 kV.

Citotoxicidade

A toxicidade de AgNPs e portadores foi avaliada usando ensaio vermelho neutro. Resumidamente, 48 h após a semeadura das células, o meio foi descartado e as diferentes concentrações de nanopartículas suspensas em meio fresco foram adicionadas. Ap� outras 24 h, o meio foi recolhido e as c�ulas foram lavadas com solu�o salina tamponada com fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich) e foi depois adicionado meio fresco com solu�o vermelha neutra a 10%. As células foram devolvidas à incubadora por mais 2 h. Em seguida, as células foram lavadas em PBS e o corante incorporado foi libertado das células de acordo com o protocolo do fabricante. A absorvância foi medida a 540 nm com referência a 690 nm no leitor de microplacas Fluostar Omega (BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Alemanha). A viabilidade das células foi expressa como a porcentagem de células não tratadas de controle (100%).

Ensaios para atividades antivirais

Queratinócitos 291.03C ou células GMK-AH1 foram semeados em placas de 24 poços (1 x 10 5 células por poço) e 24 horas depois infectadas com HSV-2 a MOI de 5. As doses de HSV-2 foram pré-incubadas, ou não, com 0.5–5 µg / ml de 10–65, 13, 33 e 46 nm AgNPs ou um portador apropriado diluído em meio de cultura completo por 0–60 minutos. O ponto de tempo de 0 minutos significa que uma dose de HSV-2 foi misturada com nanopartículas e imediatamente adicionada a cultura de células de queratinócitos 291,03C ou GMK-AH1.
Ï¿½ 24 h ap� a infec�o (h pi) recolheram-se c�ulas e sobrenadantes e titularam-se por ensaio padr� de placas em c�ulas GMK-AH1 para determinar o PFU / ml. Utilizaram-se diluies de 10 vezes de lisado congelado de culas e sobrenadantes para inocular culas GMK-AH1 numa placa de 24 pos e as culas infectadas foram mantidas em cultura durante 2 dias, em seguida as placas virais foram contadas e expressas como PFU / ml . Cada titulação foi feita em triplicado e as experiências foram repetidas três vezes.
Para analisar como as AgNPs podem influenciar a ligação viral, os queratinócitos 291.03C foram pré-refrigerados a 4 ° C por 1 h e então co-tratados com AgNPs (2.5 ou 5 µg / ml) e HSV-2 (MOI de 1) por 2 h . Após este tempo, os inóculos e AgNPs foram removidos e as monocamadas de células foram lavadas com PBS gelado, e ainda incubadas a 37 ° C. Às 24 h após a infecção, as culturas infectadas foram analisadas por ensaios de placa como descrito acima. O ensaio de penetra�o viral come�u por queratin�itos 291.03C pr� arrefecedores a 4� durante 1 h e depois as c�ulas foram infectadas durante 2 h a 4� para permitir a liga�o ao v�us mas n� a entrada. Os inulos foram removidos e as culas foram lavadas com PBS gelado antes de adicionar AgNPs (2,5 ou 5 / mL) durante 2 h a 37. As AgNPs foram depois removidas e as células foram lavadas duas vezes com PBS frio. Ap outras 18 h a 37, as culturas de culas foram submetidas a ensaios de placas como descrito acima. Para examinar os efeitos de entrada pós-viral do uso de AgNPs, 291.03C queratinócitos foram infectados a 37 ° C com MOI de 1. Após o período de adsorção, os inóculos foram removidos, as células lavadas e AgNPs (2.5 ou 5 µg / ml) foram adicionados no indicado Pontos de tempo. Às 24 h após a infecção, as culturas infectadas foram analisadas por ensaios de placa como descrito acima. O pré-tratamento foi realizado incubando queratinócitos com AgNPs (2,5 µg / ml) a 37 ° C durante 2 h, depois as células foram lavadas, infectadas e tituladas adicionalmente por ensaios de placa.

Infecção por HSV-2 de camundongos e tratamento

Ratinhos C57BL / 6 fêmeas, com 6 a 8 semanas de idade, foram adquiridos ao Centro de Investigação Médica Mossakowski (Varsóvia, Polónia). Os ratinhos foram injectados sc com 2,0 mg / kg de medroxiprogesterona (Depo-Provera; Upjohn Puurs, Bélgica) em 100 µl de PBS. Cinco dias mais tarde, os ratinhos foram infectados por inoculação intravaginal de 10 4 PFU / ratinho da estirpe 333 de HSV-2 em 20 µL de PBS previamente incubados durante 1 h com ou sem 5 µg / mL de AgNPs 13, 33 e 46 nm, ou um buffer de portadora correspondente. Para examinar o efeito antiviral do tratamento com AgNPs em animais infectados, 3 ou 18 h pi camundongos foram irrigados 3 vezes com 100 µl de 5 µg / ml de 33 nm AgNPs, ou um correspondente tampão transportador em PBS. Às 48 h pi os animais foram sacrificados e o tecido vaginal foi isolado para posterior preparação de cortes histológicos ou preservados em crioprotetor RNAlater (Sigma-Aldrich) antes da titulação do vírus. Grupos experimentais consistiram em 5-6 ratos, experimentos foram repetidos três vezes.

Titulação de vírus por RT-PCR

O ADN total foi isolado a partir dos tecidos vaginais conservados em RNAlater (Sigma-Aldrich) utilizando o estojo AllPrep DNA / RNA (Qiagen, Hilden, Alemanha). O HSV-2 foi detectado usando uma sonda HSV-2 marcada com FAM (6-carboxifluoresceína) em um instrumento de PCR em tempo real ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) e titulada conforme descrito por Namvar et al., 2005 [35]

Imuno-histoquímica de tecidos animais

Todos os tecidos vaginais foram fixados em PFA a 4% em PBS por 24 h, e depois processados ​​por técnica comum de parafina. Cortes vaginais de 5 a 6 µm de espessura foram coletados de todo o tecido vaginal a cada 50 µm usando um micrótomo rotativo (Leica RM 2125 RTS, Cingapura). Os antígenos foram desmascarados em tampão citrato 0,1 M (pH = 6) por 10 min. Os antigénios de HSV-2 foram marcados com anticorpo policlonal de coelho anti-HSV-2 (1∶250) (Dako, Glostrup, Dinamarca) e EnVision + System-HRP (Dako), de acordo com o protocolo do fabricante. Células Gr-1 positivas (neutrófilos e monócitos inflamatórios) foram detectadas usando o anticorpo anti-Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) em PBS com 1 % de albumina de soro bovino, seguida de 30 minutos de incubao com anticorpo IgG anti-rato biotinilado (BD Biosciences) e estreptavidina-peroxidase (BD Biosciences) no mesmo tamp. As seções foram desenvolvidas com 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com solução de hematoxilina de Harris (Sigma-Aldrich). A captura, análise e processamento de imagens foram realizados utilizando o microscópio Zeiss Axio Imager.M2 e o software ZEN 2011 (Zeiss). Para todas as coloraes, foram utilizados anticorpos isotipicos de controlo - IgG monoclonal de rato ou policlonal de coelho (BD Biosciences). A área de um sítio infeccioso foi medida usando o software ZEN 2011. Os números de células positivas para Gr-1 por um local infectado com HSV-2 foram contados como todas as células positivas para Gr-1, tanto mononucleares como polimorfonucleares, detectadas no local infectado dentro do epitélio vaginal. Para evitar erros de amostragem, todas as seções da etapa coletadas a cada 50 µm de todo o tecido vaginal foram coradas. A análise de imagem foi realizada independentemente por duas pessoas que desconheciam o tratamento.

Medição de citocinas

As concentraes de citocinas em lavagens vaginais foram determinadas utilizando Array de Esferas Citomtricas de Inflao de Ratinho (CBA) (BD Biosciences) de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados foram apresentados como os meios de ensaios realizados em triplicatas. Os dados foram analisados ​​usando o software FCAP Array 1.0.1 e BD Cytometric Bead Array 1.4.

Análise estatística

Os dados quantitativos foram apresentados como média ± SEM Para distribuição normal dos valores, as comparações estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student, os dados após as distribuições não gaussianas foram analisados ​​com o teste não paramétrico de Wilcoxon. O número de camundongos por grupo foi calculado com o nível de potência ajustado para 0,8 e o nível convencional de alfa (0,05) para um teste t pareado. Valores de P <0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Caracterização de AgNPs

Nanopartículas de prata em soluções estoque foram caracterizadas pela técnica de TEM e DLS ( fig. 1 ). Os resultados obtidos mostraram que os colóides testados contêm nanopartículas monodispersas com os tamanhos de 13 ± 5 nm (A), 33 ± 7 nm (B), 46 ± 9 nm (C) e 10–65 nm (D). Portanto, as AgNPs usadas para futuras pesquisas foram projetadas como 13 nm (A), 33 nm (B) e 46 nm (C) e 10–65 nm (D). Para investigar a estabilidade dos colóides, o potencial zeta foi medido. Os valores obtidos para cada colóide: (A) −31 ± 7 mV, (B) −58 ± 2 mV, (C) −56 ± 2 mV e (D) −64 ± 1 mV indicam a estabilidade das nanopartículas em um muito tempo. A estabilidade dos coloides confirmada por um teste de DLS realizado após um e seis meses a partir da data inicial de síntese mostrou que o tamanho medido das nanopartículas era constante dentro do erro de medição.
Um arquivo externo que contém uma figura, ilustração, etc. O nome do objeto é pone.0104113.g001.jpg
Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de nanopartículas de prata e histogramas de DLS.
(A) 13 ± 5 (13) nm, (B) 33 ± 7 (33) nm, (C) 46 ± 9 (46) nm e (D) 10 ± 1–65 ± 10 nm AgNPs.

A inibição da infecção por HSV-2 in vitro por AgNPs modificadas com ácido tânico é dose e tamanho

Para assegurar que as concentrações testadas de AgNPs não eram tóxicas, a citotoxicidade das nanopartículas na linhagem celular 291.03C foi avaliada usando ensaio vermelho neutro ( Tabela 1 ). A concentração citotóxica de 50% (CC50) para 33 e 46 nm AgNPs foi de aprox. 4 vezes menor do que para 13 e 10-65 nm AgNPs ( Tabela 1 ). Portanto, para ensaios infecciosos in vitro, escolhemos concentração de 5 µg / ml para 33 e 46 e 2,5 µg / ml para AgNPs de 13 nm e 10–65 nm. Os resultados de testes de toxicidade mais detalhados foram publicados anteriormente e mostraram que as AgNPs modificadas com ácido tânico de tamanho> 30 nm eram relativamente não tóxicas para os queratinócitos de camundongos [29] .

tabela 1

Citotoxicidade e actividade anti-HSV-2 de AgNPs 13, 33, 46 nm modificadas por ido tico, AgNPs 10-65 nm n modificadas ou portadores correspondentes em culas 291.03C. *
AgNPsConcentração citotóxica Média CC 50 Efeito antiviral de AgNPs
Média de EC 50 SI §
µg / ml ± SEMµg / ml ± SEM
13 nm4,18 ± 0,321,99 ± 0,022,1
33 nm30,405 ± 6,71,52 ± 0,1820,03
46 nm19,2 ± 2,12,53 ± 0,317,58
UN 10–65 nm3,83 ± 0,453,93 ± 0,790,97
portadora 13 nm28,54 ± 7,083,75 ± 0,217,62
portadora 33 nm19,94 ± 4,462,06 ± 0,499,66
portadora 46 nm16,64 ± 2,953,12 ± 0,025,34
* Os valores apresentados são médias de três experiências independentes com cada tratamento realizado em triplicado.
 Os efeitos citotóxicos foram avaliados por ensaio de vermelho neutro para determinar a concentração de 50% de citotoxicidade celular (CC 50 ) dos compostos testados.
 Os efeitos antivirais foram avaliados por ensaio de placa para determinar a concentração eficaz que atingiu 50% de inibição (EC50) contra a infecção por HSV-2.
§ SI. índice de seletividade.
CC 50 / CE 50 .
Os colóides de AgNPs modificados e não modificados de ácido tânico foram comparados com tampões contendo as mesmas concentrações de ácidos tânico e cítrico (µg / ml) que os colóides AgNPs 13, 33, 46 e 10-65 nm (ainda denominados transportadores). Os tampões transportadores mostraram toxicidade ao nível semelhante ( Tabela 1 ).
As propriedades antivirais de AgNPs na cultura de células 291.03C foram testadas por ensaio padrão de formação de placas (PFU / ml). A incubação do HSV-2 com diferentes tamanhos e concentrações de AgNPs por 60 minutos antes da infecção mostrou uma inativação do vírus dependente da dose por AgNPs modificados com ácido tânico de 13, 33 e 46 nm (p≤0,001) ( Fig. 2B-D ) e inibição de vírus muito menos eficiente por AgNPs não modificadas de 10-65 nm (p≤0,001) ( Fig. 2E ). De todos os tamanhos de AgNPs testados, 33 nm apresentaram a maior atividade antiviral já em 0,5 e 1 µg / ml em comparação com culturas infectadas com HSV-2 (95 ± 1,38% e 95,4 ± 0,42%, respectivamente) ( Fig. 2 C ). Em comparao com AgNPs de 33 nm, foi conseguido um efeito inibidor semelhante para AgNPs a 13 nm a 1 / mL (p <0,001) (96,86 2,05%) ( Fig. 2B ). Para 46 nm AgNPs, 100% de inibição foi observada na concentração de 2,5 µg / ml ( Fig. 2D ). A menor redução da formação de placa foi encontrada para AgNPs sem modificação do ácido tânico - aproximadamente 50% de inibição, independentemente da concentração (p≤0,001) ( Fig. 2E ). Os tampões transportadores foram eficazes apenas em concentrações mais elevadas, a partir de 2,5 µg / ml (p≤0,001) ( Fig. 2 ). A relação CC 50 / ED 50 , que consiste no índice de seletividade (SI), mostrou que o índice mais vantajoso foi obtido para 33 e 46 nm (20,03 e 7,58, respectivamente), enquanto 2,1 para AgNPs de 13 nm. Como o IE para 10-60 nm AgNPs foi apenas 0,97, nós focamos apenas nos efeitos antivirais das AgNPs modificadas com 13, 33 e 46 nm de ácido tânico ( Tabela 1 ). O índice de seletividade para portadores de 13, 33 e 46 nm foi de 7,62, 9,66 e 5,34, respectivamente ( Tabela 1 ).
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A inactivação da infecção por HSV-2 por AgNPs modificadas com ácido tânico é dose e tamanho relacionados.
(A) Esquema de expericias de resposta dose. Inibição viral (%) em células 291.03C infectadas com HSV-2 pré-incubadas por 1 h com 13 nm (B), 33 nm (C), 46 nm (D) AgNPs e 10-65 nm (E) AgNPs não modificadas ou respectivos tampões transportadores a 0,5, 1, 2,5 e 5 µg / ml. Às 24 h pi, as células e os sobrenadantes foram recolhidos e titulados para determinar PFU / ml em comparação com culturas infectadas com HSV-2. Os dados são expressos como médias de três experiências independentes ± SEM. * representa diferenças significativas com p≤0,001.

AgNPs modificados com ácido tânico bloqueiam a ligação e a penetração do vírus por interação direta

Para entender o (s) mecanismo (s) antiviral envolvido (s), testamos o efeito de AgNPs modificados com ácido tânico contra a ligação do HSV-2 à superfície da célula hospedeira e subsequente fusão da membrana. O uso de diferentes temperaturas - 4 ° C e 37 ° C permite examinar o efeito de AgNPs em cada etapa específica da infecção viral ( Fig. 3A ). Todas as AgNPs modificadas com ácido tânico impediram a fixação do HSV-2 em 40-80%, embora com eficiência diferente (p≤0,001) ( Fig. 3B ); o maior tamanho testado (46 nm) é o mais efetivo ( Fig. 3B ). Os portadores correspondentes também mostraram uma inibição significativa da ligação viral (p <0,05), embora menos eficiente que os AgNPs ( Fig. 3B ). Para testar se as AgNPs modificadas com ácido tânico podem prejudicar a fase de penetração, o HSV-2 foi deixado ligar-se à superfície celular a 4 ° C e depois penetrar nos queratinócitos por um desvio de temperatura para 37 ° C na presença ou ausência do teste testado. AgNPs ou portadores. Novamente, as AgNPs modificadas com ácido tânico prejudicaram a entrada do vírus com aprox. 80% de eficiência, embora não tenham sido observadas diferenças relacionadas ao tamanho (p≤0,001) ( Fig. 3B ). Os portadores não bloquearam a penetração viral de maneira significativa ( Fig. 3B ). Para entender como o HSV-2 pode interagir com AgNPs modificadas com ácido tânico, empregamos a técnica SEM equipada com espectroscopia de dispersão de energia (EDS), permitindo a análise elementar no modo SEM. Para este propósito, os viriões HSV-2 incubados com AgNPs modificados com ácido tânico foram deixados a ligar-se à superfície dos queratinócitos e depois analisados ​​em microscópio SEM com o modo EDS. As imagens obtidas mostraram que as AgNPs interagem com a superfície do vírion e, dessa maneira, as nanopartículas criam um obstáculo físico que prejudica a interação com os receptores virais na superfície celular ( Fig. 3C ).
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AgNPs modificados com ácido tânico bloqueiam a ligação e a penetração do HSV-2.
(A) Esquema de experiências de fixação e penetração. (B) Inibição viral (%) para experiências de inserção e penetração de vírus em culturas de células 291.03C com o uso de 33Nm e 46nm AgNPs (5 µg / ml) e 13nm AgNPs (2.5 µg / ml) e transportadores correspondentes. Às 24 h pi, as células e os sobrenadantes foram recolhidos e titulados para determinar PFU / ml em comparação com culturas infectadas com HSV-2. (C) SEM imagens no modo EDS de HSV-2 incubadas com AgNPs 13 nm, 33 nm e 46 nm, setas brancas indicam nanopartículas na superfície do viron. Barras brancas indicam 100 nm. (D) Cinética da interação AgNPs e HSV-2 expressa como% de controles positivos infectados pelo HSV-2. Alíquotas de HSV-2 foram misturadas com 2,5 µg / ml de AgNPs 13,33 ou 46 nm ou portadores correspondentes, incubadas por pontos de tempo indicados, então usadas para infectar células GMK-AH1 e determinar PFU / ml em comparação com culturas infectadas com HSV-2 . Os dados são mostrados como significados a partir de três experiências independentes ± SEM. * representa diferenças significativas com p ≤ 0,05, enquanto ** p ≤ 0,001.
A cinética da interação AgNPs e vírus ( Fig. 3D ) mostrou que o processo de inativação de HSV-2 por AgNPs modificados com ácido tânico é rápido e sua eficiência aumenta com o tempo de tratamento ( Fig. 3D ). A exposição ao HSV-2 a 2,5 µg / ml de AgNPs de 33 e 46 nm inibiu a infecção já em 0 minuto (13,62 ± 1,6% e 23,7 ± 1,67% do controle infectado, respectivamente) (p≤0,001) ( Fig. 3D ). O tratamento com vírus com 2,5 µg / ml de 13 nm de AgNPs resultou numa inibição significativa da infecção após um tratamento mais longo de 5 min (29,4 ± 1,49%) (p≤0,001) ( Fig. 3D ). Novamente, as AgNPs de 33 nm apresentaram a maior inibição da infecção pelo HSV-2 após 60 min de incubação (p≤0,001) (0,7 ± 0,09%) de todos os tamanhos de AgNPs testados ( Fig. 3D ). Os portadores correspondentes foram caracterizados por inibição viral mais lenta e menos eficiente durante 60 minutos de incubação em comparação aos AgNPs (p≤0,01), exceto para o portador de 13 nm em 0 minuto, que inibiu a infecção pelo HSV-2 mais eficientemente que AgNPs de 13 nm (p <0,01) ( Fig. 3D ).
Para investigar a possibilidade de bloquear os receptores celulares com AgNPs modificados com ácido tânico, nós incubamos 291.03C células antes da infecção com 2.5 µg / ml de AgNPs 13, 33 e 46 nm ou portadores correspondentes por 2 h. A incubação das células com 33 e 46 nm ou portadores não resultou na inibição da infecção por HSV-2 (94,36 ± 8,39% e 100 ± 9,57%, respectivamente) em comparação com o controlo infectado não tratado (100 ± 7,72%) (p≥ 0,05) ( Fig. 4A ). Apenas 13 nm AgNPs diminuiu significativamente a infecção (79,17 ± 7,4%) (p≤0,05) ( Fig. 4A ).
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Os efeitos antivirais de AgNPs modificados com ácido tânico requerem interação direta.
(A) Esquemas e resultados para experimentos de pré-tratamento. Os resultados são expressos como% de controle infectado por HSV-2 em células 291.03C pré-tratadas com 2.5 µg / ml de 13Nm modificadas com ácido tânico, 33 nm e 46 nm AgNPs ou respectivos portadores por 2 h, então infectadas com HSV- 2 (B) Esquemas para experiências pós-tratamento. Os resultados são expressos como percentagem de inibição viral em culturas de células 291.03C infectadas com HSV-2, em que meio completo contendo 33 nm e 46 nm AgNPs (5 µg / ml) e 13 nm AgNPs (2.5 µg / ml) ou respectivos transportadores foram adicionado nos pontos de tempo indicados por até 24 h. Os dados são mostrados como significados a partir de três experiências independentes ± SEM. * representa diferenças significativas com p≤0,05.
Para avaliar a atividade antiviral pós-infecção de AgNPs modificados com ácido tânico, monocamadas de células 291.03C foram infectadas com HSV-2 e 13, 33 ou 46 nm AgNPs ou portadores correspondentes foram adicionados após 2, 6 e 12 h de infecção ( Fig. 4B ). A adição de AgNPs modificados com ácido tânico a partir de 2 h após a infecção (pi) levou ao efeito inibitório antiviral estável e significativo de aproximadamente 30% (p≤0,05) ( Fig. 4B ). Na concentrao de 5 / mL, AgNPs de 33 e 46 nm mas tamb AgNPs de 13 nm na concentrao de 2,5 / ml exerceram efeito antiviral similar ( Fig. 4B ). Os portadores inibiram significativamente a infecção por HSV-2 apenas quando adicionados a 2 h pi (p≤0,003) ( Fig. 4B). Estes dados indicam que a infecção por HSV-2 está gravemente comprometida se as AgNPs estiverem presentes no momento da infecção ou em algum mecanismo de disseminação viral (vírus livre de células).

AgNPs modificados com ácido tânico reduzem a infecção por HSV-2 in vivo

Para confirmar nossos achados in vitro , usamos o bem estabelecido modelo murino de infecção genital por HSV-2 [36] . Para expericias in vivo , incubamos HSV-2 durante 1 h antes da infeco com 5 / mL de AgNPs 13, 33 e 46 nm modificadas com ido tico, depois utilizaram-se as misturas para infeco intravaginal de ratinhos C57BL6 ( Fig. 5A ). No pico da infecção vaginal local (48 h pi), observamos que a incubação do HSV-2 com todas as AgNPs testadas reduziu significativamente os títulos virais medidos por PCR em tempo real em comparação com o controle infectado pelo HSV-2 (p≤0,001) ( Fig. 5B ). AgNPs de 13 e 46 nm induziram um efeito antiviral similar durante a infecção por HSV-2 in vivo , mas 33Nm AgNPs foram os mais efetivos na diminuição de títulos de vírus (33 vs. 13 e 46 nm AgNPs, p≤0,05) ( Fig. 5B ) . O pré-tratamento de HSV-2 com portadores correspondentes não diminuiu significativamente os títulos de HSV-2 in vivo ( Fig. 5B ).
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As AgNPs modificadas com ácido tânico reduzem a infecção por HSV-2 in vivo .
(A) Esquema de expericias in vivo . Camundongos C57BL / 6 foram infectados com HSV-2 pré-incubado ou não com AgNPs 13, 33 e 46 nm ou portadores correspondentes (5 µg / ml). (B) Títulos de ADN de HSV-2 (cópias / µg de ADN) em todos os tecidos vaginais, determinados por PCR em tempo real às 48 h pi (N = 6).(C) Tamanhos de locais infectados determinados por imuno-histoquímica de antigénios de HSV-2. (D) Esquema do tratamento pós-infecção às 3 e 18 h pi com 33 AgNPs ou tampão transportador (3 x 100 µl a 5 µg / ml) (N = 5). (E) Títulos de ADN de HSV-2 (cópias / µg de ADN) em todos os tecidos vaginais, determinados por PCR em tempo real às 48 h pi (N = 6). (F) Tamanhos de locais infectados determinados por imuno-histoquímica de antigénios de HSV-2 (N = 5). As barras representam médias de três experiências independentes ± SEM. * representa diferenças significativas com p ≤ 0,05, enquanto ** p ≤ 0,001.
A mensuração das áreas de lesão infecciosa mostrou que o tratamento com AgNPs levou a uma redução significativa da área infectada (p≤0,001) ( Fig. 5C ). O tratamento com HSV-2 com 13 e 33 nm de AgNP antes da infecção resultou numa redução semelhante das áreas infectadas em comparação com o controlo positivo infectado ( Fig. 5C ). A incubação do HSV-2 com AgNPs de 46 nm levou à menor redução das áreas de infecção no tecido vaginal em comparação com o controle infectado pelo HSV-2 ( Fig. 5C ). O pré-tratamento do HSV-2 com portadores correspondentes diminuiu o tamanho médio de uma área infecciosa, embora de forma insignificante ( Fig. 5C ).
Além disso, decidimos avaliar o uso potencial de AgNPs como um agente antiviral em animais com infecção intravaginal por HSV-2 em andamento. Para estudar os efeitos do tratamento pós-infecção, os animais foram infectados com HSV-2 não tratado e, em seguida, os tecidos vaginais foram irrigados três vezes com 33 nm AgNPs ou o portador correspondente em 3 ou 18 h pi ( Fig. 5D ). Após 48 h pi, os tecidos vaginais foram utilizados para medição dos títulos de vírus e tamanho dos locais infecciosos ( Fig. 5E e F ). O tratamento pós-infecção com 33 nm AgNPs resultou em uma diminuição significativa dos títulos virais para ambos os pontos de tempo apenas para AgNPs (p≤0,001) ( Fig. 5E ). Os títulos de vírus foram significativamente mais reduzidos para o tratamento com AgNPs às 18 h pi em comparação com o tratamento às 3 h pi (p≤0,01) ( Fig. 5E ). A medição da área dos locais infecciosos no tecido vaginal tratado com AgNPs demonstrou uma diminuição significativa e similar no tamanho das áreas infecciosas em ambos os momentos de tratamento, em comparação com o controle não tratado infectado (p≤0,001) ( Fig. 5F ). O tratamento com 33 nm transportadora resultou em uma diminuição significativa de um tamanho de área infecciosa apenas por 3 h pi tratamento (p≤0,05) ( Fig. 5F ).

AgNPs modificados com ácido tânico reduzem e regulam a reação inflamatória in vivo durante a infecção por HSV-2 de maneira relacionada ao tamanho

Para testar propriedades inflamatórias de nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico, com ou sem infecção, foi realizada a coloração com o mAb anti-receptor de granulócitos-1 (Gr-1), clone RB6-8C5 em (i) os tecidos vaginais tratados com 100 µl de 13, 33 e 46 nm de AgNPs ou transportadores correspondentes (5 / mL) 48 h ap tratamento mas tamb (ii) em ratinhos infectados com HSV-2 tratados com AgNPs ou transportadores. Este anticorpo liga-se ao Ly6G, que está presente nos neutrófilos, e ao Ly6C, que é expresso nos neutrófilos, e subpopulações de monócitos (Ly6G + e Ly6C +). Ambas as populações de células participam ativamente da inflamação precoce durante a infecção pelo HSV-2 [37]. Em todos os tecidos vaginais não infectados testados, foram observados neutrófilos individuais na lâmina própria vaginal, mas não foi detectada nenhuma influência significativa sobre a resposta inflamatória local no tecido vaginal ( Fig. 6A ). No modelo HSV-2, descobrimos que o pré-tratamento de HSV-2 com ácido nítrico modificado 13, 33 e 46 nm AgNPs reduziu significativamente o número de células Gr-1 + dentro das lesões infecciosas no tecido vaginal em 48 h pi (p ≤0,01) ( Fig. 6A, B ). O pré-tratamento do HSV-2 com os portadores correspondentes não diminuiu significativamente a reação inflamatória durante a infecção subseqüente ( Fig. 6A, B ). Além disso, o tratamento com 33 nm AgNPs a 3 e 18 h pi reduziu significativamente o número de células Gr-1 + presentes nos locais infectados (p≤0,01) (Fig. 6 C ). O transportador para 33 nm AgNPs reduziu a reação inflamatória apenas para tratamento em 3 h pi (p≤0,01) (Fig. 6 C ).
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As AgNPs modificadas com ácido tânico reduzem a inflamação durante a infecção por HSV-2 em camundongos C57BL / 6.
(A) Colorao imuno-histoquica para culas Gr-1 + no tecido vaginal de ratinhos de controlo, ratinhos 48 h ap tratamento com 13, 33 e 46 nm AgNPs ou transportadores correspondentes (5 / ratinho); ratinhos a 48 h pi com HSV-2 princubado com AgNPs 13, 33 e 46 nm ou veulos correspondentes. (B) Números de células Gr-1 + / sítio infeccioso no tecido vaginal às 48 h pi, o HSV-2 foi pré-tratado, ou não, com 13, 33 e 46 nm AgNPs ou portadores correspondentes. (C) Neros de culas Gr-1 + / local infeccioso no tecido vaginal, 48 h pi ap tratamento a 3 e 18 h pi com 33 AgNPs ou o correspondente tamp transportador. As barras representam médias de três experiências independentes ± SEM (N = 5). * p≤0,01.
Para verificar ainda mais como as AgNPs influenciam a produção de citocinas e quimiocinas durante ainfecção in vivo pelo HSV-2, avaliamos as lavagens vaginais para a produção de interleucinas (TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p70, IFN-γ) e quimiocina CCL2. Em comparao com controlos infectados com HSV-2, a presen de 13 nm AgNPs na infeco resultou na produo significativamente regulada de IFN-, IL-10 e CCL2 (p <0,05) ( Fig. 7B, D e E ). A presença de 33Nm AgNPs na infecção levou a um aumento significativo do TNF-α, IL-10, CCL2 e IL-6 regulada para baixo (p≤0,05) ( Fig. 7A, C, D, E ), enquanto 46 As AgNPs nm diminuíram significativamente o TNF-α e IL-6 (p≤0,05) ( Fig. 7A, C). Não foram observadas diferenças significativas na produção de IL-12p70 (dados não mostrados). O pré-tratamento do HSV-2 com os transportadores correspondentes aumentou significativamente a produção de todas as citocinas testadas, exceto IL-6 e IL-10 (p≤0,05) ( Fig. 7 ).
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As AgNPs modificadas com ácido tânico regulam a produção de citocinas e quimiocinas de uma maneira relacionada ao tamanho.
Produção de TNF-α (A), IFN-γ (B), IL-6 (C), IL-10 (D) e CCL2 (E) nas lavagens vaginais de ratinhos C57BL / 6 não infectados ou infectados com HSV-2 a 48 h com a dose de vírus pré-incubada ou não com AgNPs 13, 33 e 46 nm ou portadores correspondentes. (F) produção de INF-γ, IL-10 e CCL-2 nas lavagens vaginais de murganhos tratados a 3 e 18 h pi com 33 nm AgNPs ou o correspondente tampão transportador (3 x 100 µl de 5 µg / mL). As barras representam médias de 3 experiências separadas ± SEM (N = 5). * representa diferenças significativas com p≤0,05, ** p≤0,01. nd - não detectado.
Curiosamente, o tratamento com 33 nm AgNPs a 3 e 18 h pi de produção regulada de IFN-γ, IL-10 e CCL2 (p≤0,05) ( Fig. 7F ). O tratamento com o portador correspondente tamb conduziu a uma regulao positiva dos neis de IFN- e CCL2 em ambos os pontos temporais (p0,05) mas n se observou produo de IL-10 ( Fig. 7F ). Não foi detectada uma regulação positiva significativa de todas as citoquinas testadas e CCL2 nos animais de controlo tratados com AgNPs ou veículos correspondentes.

Discussão

Há uma forte associação entre doenças sexualmente transmissíveis bacterianas e virais (DSTs) e a aquisição e transmissão da infecção pelo HIV. A maioria das evidências sobre o papel das DSTs na transmissão e controle do HIV é focada no HSV-2 [28] , [38]. Portanto, o desenvolvimento de pequenas moléculas capazes de inibir a infecção por HSV-2 representa uma estratégia terapêutica atrativa, particularmente em indivíduos imunocomprometidos que estão em risco de gerar cepas de HSV-2 resistentes ao tratamento padrão com aciclovir. Os microbicidas ideais devem agir bloqueando as interações do receptor da superfície celular e do vírus, inibindo assim a ligação / entrada do vírus e, possivelmente, bloqueando a disseminação célula-a-célula. Ligantes ligados a nanopartículas têm potencialmente maior afinidade para interagir com moléculas alvo devido à sua orientação espacial e grande área superficial.
A idéia de nanopartículas, como antivirais candidatos em doenças sexualmente transmissíveis, como o vírus da hepatite B (VHB) [21] , HIV-1 [19] , [20] , [39] , [40] e HSV [23] , [39] ] , [41] já foi explorado. Mohammed Fayaz et al., (2012) testaram o preservativo de poliuretano revestido com AgNPs (PUC) pela capacidade de interromper a infectividade do HSV e mostraram que o contato do PUC revestido com AgNPs tanto com o HSV-1 quanto com o HSV-2 foi capaz de inativar eficientemente infectividade em células Vero E6 [39] .
Além disso, nanopartículas modificadas de metais nobres também provaram sua eficiência antiviral. Nanopartículas revestidas com polivinilpirrolidona (AgNPs revestidas com PVP) inibiram a transmissão do HIV-1 nos explantes da cultura cervical humana, sendo um promissor candidato microbicida para prevenir a transmissão do HIV-1 in vivo [40] . Nanopartículas de prata cobertas com mercaptoetanossulfonato (Ag-MES) e nanopartículas de ouro cobertas com mercaptoetano sulfonato (Au-MES) mostraram inibir a infecção por HSV-1 in vitro [23] , [41] .
Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos antivirais de nanopartículas de prata modificadas com ácido tânico à infecção por HSV-2 in vitro e in vivo.em concentrações não tóxicas para as células hospedeiras. A modificação do ácido tânico forneceu a mais alta eficiência do efeito inibitório, uma vez que as nanopartículas de prata sem modificação do ácido tânico (10-65 nm) não atuaram tão rápida e eficientemente quanto as AgNPs modificadas. Além disso, nossos dados mostram que a infecção viral foi inibida apenas quando os viriões AgNPs modificados com ácido tânico e HSV-2 interagiram diretamente entre si. O pré-tratamento de células hospedeiras com as AgNPs modificadas com ácido tânico não teve efeitos inibitórios sobre a entrada de HSV-2. Isto indica que é improvável a ligação de receptores de superfície celular ou factores de entrada celular para HSV-2 pelas AgNPs modificadas com ácido tânico.
A entrada e disseminação do HSV-2 requerem uma combinação de proteínas de superfície viral. Os heterodímeros gB, gD e gH-gL são as principais glicoproteínas do HSV-2 para a entrada viral e a transmissão célula a célula em células epiteliais cultivadas [1] - [3] . Dada a alta afinidade dos taninos por proteínas e açúcares [6] , [7] , o ácido tânico pode ligar glicoproteínas nos viriões infecciosos, tornando-os inertes, prejudicando a função das glicoproteínas e impedindo o sucesso de fixação e entrada da célula hospedeira. Um efeito similar de bloquear a entrada do HSV-1 por taninos hidrolisáveis ​​foi previamente mostrado [11] , [15]. Além disso, as propriedades antivirais dos taninos podem não ser específicas para proteínas virais particulares, uma vez que uma atividade antiviral de amplo espectro de taninos contra vírus envelopados, como o citomegalovírus humano (HCMV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da dengue (DENV). ), vírus do sarampo (MV) e vírus sincicial respiratório (RSV) foi demonstrado [42] . Muitas glicoproteínas virais têm múltiplos papéis, incluindo a ligação aos receptores da célula hospedeira e a mediação da fusão da membrana. Portanto, os taninos, mas também os AgNPs modificados com ácido tânico, podem ter como alvo mais de uma etapa da infecção, incluindo a fixação do vírus, a entrada e a disseminação de célula para célula.
Neste estudo, mostramos que os efeitos antivirais de AgNPs modificados com ácido tânico foram mais eficientes do que o próprio ácido tânico em tampões transportadores em termos de bloqueio da fixação do vírus, penetração e disseminação célula-a-célula após a infecção inicial. Além disso, as AgNPs modificadas com ácido tânico foram melhores antivirais para infecção in vivo , também para tratamento.
Podemos supor que a modificação das AgNPs pelo ácido tânico aumenta a afinidade biológica das AgNPs pelas glicoproteínas virais, enquanto o tamanho físico, juntamente com a atividade antiviral da prata, aumenta o efeito total.
Dependendo do tipo de célula, existem duas vias principais de entrada do HSV nas células hospedeiras - não endocíticas e endocíticas [1] - [3] . No entanto, em todas as vias de entrada, o HSV utiliza um conjunto semelhante de glicoproteínas de superfície viral para entrar nas células hospedeiras. O primeiro passo na entrada do HSV é a ligação do HSV através das glicoproteínas do envelope a receptores na superfície da célula hospedeira [1] - [3]. Essa interação permite a ancoragem firme da partícula do virion à membrana plasmática da célula hospedeira e, eventualmente, leva à fusão da membrana e à penetração do vírus na célula hospedeira. Aqui, as nanopartículas de prata de todos os tamanhos testados bloquearam a penetração do vírus de maneira semelhante, enquanto o bloqueio da ligação do vírus aumentou com o tamanho. É possível que interagindo com a superfície do vírus através de moléculas de ácido tânico, AgNPs criam um obstáculo físico impedindo a penetração do vírus (Fig. S1). O tamanho das AgNPs também pode decidir sobre a eficiência da interação vírus - AgNPs. Em escala nanométrica, os locais ativos na superfície da partícula aumentam exponencialmente à medida que o tamanho da partícula diminui. Em outras palavras, a superfície de interação para nanopartículas pequenas é muito maior do que para as maiores [43] .
Levando em conta a estrutura do vírus que consiste em picos de glicoproteínas com o espaçamento médio de 9 a 13 nm [44] de centro para centro , podemos esperar que as maiores AgNPs, a menor eficiência de ligação com a superfície do vírion (Fig. S1). As imagens de SEM da ligação de AgNPs - HSV-2 ( Fig. 3 ) confirmam esta sugestão mostrando interação múltipla de 13 nm AgNPs com o virion, enquanto 46 nm AgNPs mostram muito menos ligação. No total, isto pode explicar a maior eficácia anti-viral de 33 AGNPS nm, proporcionando o tamanho mais eficiente para nanopartícula - interacções do viri, que é também reflectida com o efeito da dose mais vantajosa ( Fig. 2 ) e cinética rápida de inibição viral ( Fig 3 ).
As AgNPs de ácido tânico também exercem atividade anti-viral no estágio da disseminação do vírus. Múltiplas estratégias de disseminação para HSVs foram descritas, incluindo: transmissão de virions livres, movimentação de HSV ao longo de protrusões de membranas celulares semelhantes a filopódios (surfe) em direção ao corpo celular e disseminação célula a célula lateral [1] - [3] . As AgNPs modificadas com ácido tânico adicionadas a cultura infectada com HSV-2 a partir de 2 h pi mostraram semelhantes, embora apenas aprox. 30% da inibição viral, o que sugere que eles não são ativos em relação a todas as formas de disseminação viral, como por exemplo o surfe viral, mas precisa de mais esclarecimentos.
Estudos anteriores mostraram que nanopartículas de pequeno porte foram mais eficientes na inibição da infectividade dos vírus analisados. AgNPs variando de 1 a 10 nm interagiram com a proteína gp120 do HIV para inibir a ligação viral à célula hospedeira [19] e nanopartículas de prata com um diâmetro de 25 nm foram eficazes no bloqueio da penetração da célula hospedeira do vírus vaccinia [45] . Nanopartículas de prata produzidas por diferentes fungos foram submetidas a uma interação dependente do tamanho com os vírus herpes simplex tipos 1 e 2 e com o vírus humano parainfluenza tipo 3, nanopartículas de prata AgNPs de 4 a 13 nm e 5 a 23 nm tendo a melhor atividade antiviral [46]. As interações entre nanopartículas de prata e vírus foram estudadas usando nanopartículas uniformes esféricas. O estudo de Pal et al. [2007] mostraram que as nanopartículas de prata sofrem interação dependente da forma com a bactéria gram-negativa E. coli [47], mas os efeitos exatos dessas interações requerem mais estudos.
Enquanto 13Nm AgNPs mostraram boas propriedades antivirais em concentrações menores, eles ainda eram tóxicos com um baixo índice de seletividade, entendido como a razão entre o efeito inibitório e a toxicidade ( Tabela 1 ). A toxicidade de AgNPs de tamanho pequeno deve ser levada em conta quando se considera o uso potencial como microbicidas e tem sido amplamente estudado. Os estudos in vitrorevelaram que AgNPs induzem a produção de espécies reativas de oxigênio levando a apoptose ou necrose, perda de potencial mitocondrial e genotoxicidade em células expostas [48] , [49] . A avaliação da toxicidade in vivo mostrou aumento na agregação plaquetária, acúmulo de AgNPs no fígado e capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica [49]. A toxicidade das nanopartículas também é dependente do tamanho, com as nanopartículas mais pequenas sendo as mais tóxicas, embora o efeito direto também dependa do tipo de células afetadas. Liu et al. (2010) mostraram que a toxicidade de nanopartículas de prata em quatro linhas celulares humanas derivadas de diferentes tecidos (A549, HepG2, SGC7901 e MCF-7) dependiam do seu tamanho, com partículas de 5 nm mais tóxicas que 20 e 50 nm [50] . Por outro lado, os queratinócitos epidérmicos humanos (HEKs) não apresentaram citotoxicidade diferente quando expostos a 20, 50 e 80 nm AgNPs [51] . Anteriormente, mostramos que AgNPS de 13 nm modificados com ácido tânico eram mais tóxicos do que AgNPs de ácido tânico de tamanho maior [29].. A toxicidade de 13 nm AgNPs também foi dependente do tipo celular, com monócitos, mas não queratinócitos, produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) na exposição [29] . Portanto, apesar de sua eficiência antiviral, as AgNPs de 13 nm são menos promissoras que os microbicidas.
Durante a infecção por HSV-2, a mucosa vaginal é submetida ao desenvolvimento de lesões inflamatórias, influenciando a integridade do epitélio da mucosa [31] . Todas as AgNPs testadas foram capazes de diminuir significativamente os títulos de vírus e o tamanho das lesões infectadas no pico da infecção (48 h pi). Além disso, o tratamento com AgNPs de 33 nm, tendo a melhor relação toxicidade / efetividade, ajudou a reduzir a infecção quando aplicado tanto cedo quanto depois da infecção (3 e 18 h pi). Os tampões transportadores contendo as mesmas concentrações de ácido tânico não mostraram efeito antiviral in vivo , enquanto o tratamento funcionou apenas reduzindo o tamanho das lesões infectadas precocemente durante a infecção. Estes resultados contrastam com muitos estudos que mostram uma boa eficiência antiviral dos taninos in vitro. [11] , [15] .
Fagócitos profissionais (granulócitos e monócitos / macrófagos de neutrófilos) constituem uma importante primeira linha de defesa contra intrusos microbianos, incluindo a infecção pelo HSV-2 [52] . No entanto, a reação inflamatória excessiva durante a infecção pelo HSV-2 aumenta o tamanho do local infectado e contribui para a disseminação do vírus [37]. Portanto, um microbicida anti-HSV-2 ideal deve inibir a infecção viral e regular a reação inflamatória local ao mesmo tempo. Observamos que todas as AgNPs testadas, mas não portadoras correspondentes, diminuíram significativamente o número de células positivas para Gr-1 (neutrófilos e monócitos inflamatórios) dentro do tecido vaginal durante a infecção por HSV-2, enquanto as mesmas doses de AgNPs não levaram a nenhuma infecção. reação inflamatória detectável em camundongos controle não infectados. O tratamento com 33Nm AgNPs também reduziu a inflamação.
Mostrou-se que nanopartículas de prata diminuem os níveis de marcadores inflamatórios em camundongos feridos [53] e em macrófagos de camundongos infectados por Chlamydia trachomatis in vitro [54] . No entanto, estudos em ratos expostos a nanopartículas de prata por instilação intratraqueal detectaram aumento da produção de IL-6, CCL2 e TNF-α no lavado broncoalveolar (LBA) [55] . Nós já descrevemos anteriormente que monócitos expostos in vitro a AgNPs modificados com ácido tânico modificam fortemente a produção de TNF-α, enquanto os queratinócitos mostraram um efeito oposto ao aumento da produção de TNF-α. [29]. Portanto, devemos levar em conta o fato de que, dependendo do tamanho, efeitos tóxicos e tipo de célula, as nanopartículas de prata influenciam a resposta inflamatória de maneira diferente e o efeito in vivo observado pode consistir na soma de todas as reações específicas da célula. Aqui, a produção de citocinas e quimiocinas durante a infecção por HSV-2 mostrou diferenças relacionadas ao tamanho para cada tipo de nanopartícula - a presença de 13 nm AgNPs no momento da infecção levou à produção de CCL2, IFN-γ e IL-10, enquanto 33 nm AgNPs induzidas CCL2, TNF-α e IL-10. AgNPs de tamanho maior - 46 nm influenciaram a produção de apenas IL-6. O tempo de tratamento pós-infecção também influenciou o perfil das citocinas produzidas.
TNF-α, IFN-γ, IL-6 são citocinas importantes para a montagem de uma resposta antiviral adaptativa adequada ao HSV-2 [56] - [58] , enquanto a CCL2 pode atrair monócitos e células T para o local da infecção [59] . [60] . O TNF-α também pode induzir a expressão de CCL2 e mobilizar monócitos / macrófagos e células T através do receptor de quimiocinas CCR2 [61] . A IL-6 apoia a diferenciação e a proliferação de células B e T [62] e tanto o HSV tipo 1 como o tipo 2 são indutores potentes da IL-6 [63] . O IFN-γ é necessário para a depuração do HSV-2 no epitélio genital por células T CD8 + e é produzido por células natural killer precocemente durante a infecção [64]. Os tampões transportadores contendo ácido tânico na verdade aumentaram a produção de TNF-α, CCL2 e IFN-γ apesar da falta de qualquer inibição viral, enquanto apenas AgNPs modificados com ácido 13 e 33 nm tânico induzem a produção de IL-10 ( Fig. 7 ). A interleucina-10 é uma citocina anti-inflamatória, cuja produção é importante na montagem adequada da resposta anti-HSV-2 [65] . Embora os efeitos antiinflamatórios do ácido tânico in vitro tenham sido descritos anteriormente [14] , aqui não observamos redução da resposta inflamatória pelos portadores. A resposta precoce anti-HSV-2 in vivoenvolve uma pletora de células, tais como neutrófilos, macrófagos, monócitos, células assassinas naturais e células dendríticas, que, após a infecção, produzem diferentes citocinas e quimiocinas. O equilíbrio da rede de citocinas pode regular o aumento ou inibição das respostas imunes inflamatórias e adaptativas. Como mencionado anteriormente, a influência das AgNPs pode ser crítica, mas também uma questão complexa, portanto, é necessário que mais estudos sejam realizados em diferentes tipos de células in vitro e in vivo , durante os estágios posteriores da infecção pelo HSV-2.
Em conclusão, demonstramos que as AgNPs modificadas com ácido tânico têm a capacidade de prevenir a infecção por HSV-2 por inibição direta da inserção do vírus, penetração e disseminação pós-infecção. O ácido tânico usado nas mesmas concentrações mostra efeitos antivirais significativamente inferiores, particularmente quando usado in vivo . Portanto, as AgNPs modificadas com ácido tânico podem consistir em bons candidatos para um microbicida anti-HSV-2 eficaz a ser utilizado in vivo devido à sua eficácia em concentrações mais baixas e à indução de uma resposta anti-inflamatória.
Como tanto o HSV-1 quanto o HSV-2 possuem estrutura similar de proteínas de superfície, AgNPs modificados com ácido tânico podem ser usados ​​não apenas como microbicida para tratar infecções por HSV-2 na área anogenital, mas também para tratar infecções por herpes oral na forma de um gel protetor ou creme para ser aplicado topicamente.
ESTUDO COMPLETO COM IMAGENS
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